【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和医疗器械检测，具体涉及一种活性结核分枝杆菌的定量检测方法、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、肺结核（又称痨病）是结核病中最常见的一种，属于一种慢性传染病，结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，mtb）又称结核杆菌或结核菌，通过吸入含菌飞沫而感染人体，侵入人体后主要侵犯肺脏，因此，结核分枝杆菌是导致肺结核的主要微生物，对公共健康构成重大威胁。
2、目前，对结核分枝杆菌的检测主要依靠抗酸染色（痰涂片）、细菌培养（或痰培养），以及xpert mtb/rif等为代表的核酸检测等方法。痰培养与痰涂片（敏感性为约为50%）均存在敏感性低、特异性差等问题；其中，痰培养虽然是结核病诊断的金标准，但出结果的时间较长（2-8周）；而痰涂片虽然能够在24小时内出结果，检测相对快速、简单，但是灵敏度相对较低，其检测结果阴性并不能完全排除肺结核的可能性。结核分枝杆菌的核酸检测方法，如以dna为靶标的xpert mtb/rif，可以显著提高检测的敏感性和时效性，但由于dna的稳定性，体外扩增检测的dna模板可以来自于活菌也可以来自于死菌，不适合作为区分活动期肺结核（active tuberculosis，atb）的良好检测标志。
3、相对于稳定的dna，rna主要包括核糖体rna (rrna)、转移rna (trna)和信使rna(mrna)，不同类型的rna以不同的稳定性存在于不同的物种中。信使rna(mrna)是合成蛋白质的蓝图，与基因表达相关、也与结核分枝杆菌的活性和生存
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以mtb 16s rrna与基因组dna共同为检测靶标，建立了一种快速、敏感、特异、能够真正区分活性结核分枝杆菌，并能够检测活性结核分枝杆菌相对表达量的定量检测方法。
2、为达到上述目的或目的之一，本专利技术提供了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种引物组合物，用于对活性结核分枝杆菌进行核酸检测，以mtb 16s rrna为靶标基因的引物组合物包含反转录引物和特异性扩增引物，反转录引物包括标签引物的核苷酸序列和用于特异性反转录扩增mtb 16s rrna的核苷酸序列，特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；其中，标签引物和上游引物的核苷酸序列相同、为seq id no：3所示；用于特异性反转录扩增mtb 16s rrna的核苷酸序列为seq id no：2所示；下游引物的核苷酸序列为seq id no：4所示。
4、根据本专利技术的一个优选实施例，在引物组合物中，反转录引物的核苷酸序列为seqid no：1所示。
5、根据本专利技术的一个优选实施例，在引物组合物中，还包括分别以结核分枝杆菌的is6100和海洋分枝杆菌的mm tmrna为靶标基因的特异性扩增引物，特异性扩增引物分别包括对应的上游引物和下游引物。
6、根据本专利技术的一个优选实施例，以特异性扩增引物为基础进行qpcr扩增时，引物组合物还包括对应的5’端都标记有荧光基团、3’端都标记有淬灭基团的探针。
7、优选地，荧光基团为fam、hex、rox；淬灭基团为bhq1、bhq2；
8、进一步优选地，荧光基团为fam时，淬灭基团为bhq1；荧光基团为hex、rox时，淬灭基团为bhq2。
9、第二方面，本专利技术提供了一种对活性结核分枝杆菌的检测方法，利用上述引物组合物对结核分枝杆菌进行核酸检测，以mtb 16s rrna为靶标基因分别进行反转录扩增和特异性扩增，反转录扩增包括步骤一和步骤二，特异性扩增为qpcr扩增；其中，步骤一包括加入反转录体系一执行反转录程序一，步骤二包括将步骤一完成后的反转录体系一短暂离心后加入反转录体系二，然后执行反转录程序二，步骤二完成后的产物为反转录产物；qpcr扩增的模板为反转录产物，对应的qpcr反应体系总体积为50μl；执行qpcr扩增的反应程序后即可获得待测样本的扩增曲线及阳性扩增结果的ct值。
10、根据本专利技术的一个优选实施例，反转录扩增和特异性扩增优选的反应条件包括：反转录扩增中，反转录体系一的总体积10μl，包括：1μl 10mm dntps、1μl反转录引物和8μl的反转录模板；反转录程序一为：50～65℃反应5～10min后于冰上冷却1～5min；反转录体系二的总体积10μl，包括：2μl 10×反转录缓冲液、4μl 25mm mgcl2、2μl 0.1 m dtt、1μl重组核糖核酸酶抑制剂和1μl反转录酶；反转录程序二为：45～55℃反应45～60min后、于75～85℃加热灭活5～10min、再于低温冷却；qpcr反应体系包括：2×增强型tag酶预混液25μl，浓度为5～20pmol/μl的上游引物和下游引物各1μl，浓度为5～20pmol/μl探针2μl，反转录产物2μl，补充ddh2o至50μl；qpcr扩增的反应程序为：第一步，94℃～96℃预变性30sec～60sec；第二步，94～96℃变性4sec～10sec，55℃～61℃退火延伸30sec～60sec，如此37～45个循环；第三步，依次94～96℃变性5～10sec、60～65℃退火延伸5～10sec、94～96℃变性5～10sec。
11、优选地，反转录体系一中，反转录引物浓度为2pmol/m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物组合物，其特征在于：用于对活性结核分枝杆菌进行核酸检测，以MTB 16SrRNA为靶标基因的引物组合物包含反转录引物和特异性扩增引物，所述反转录引物包括标签引物的核苷酸序列和用于特异性反转录扩增MTB 16S rRNA的核苷酸序列，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；其中，
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述反转录引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：以特异性扩增引物为基础进行qPCR扩增时，所述的引物组合物还包括对应的5’端都标记有荧光基团、3’端都标记有淬灭基团的探针。
4.一种对活性结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于：利用权利要求1-3任一项中所述的引物组合物对活性结核分枝杆菌进行核酸检测，以MTB 16S rRNA为靶标基因分别进行反转录扩增和特异性扩增，所述反转录扩增包括步骤一和步骤二，所述特异性扩增为qPCR扩增；其中，
5.根据权利要求4所述的对活性结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于：所述反转录扩增和所述特异性扩增优选的反应条
6.根据权利要求4所述的对活性结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于：对同一待测样本进行qPCR扩增的靶标基因还包括以结核分枝杆菌的IS6100和/或海洋分枝杆菌的MMtmRNA，qPCR扩增反应体系和反应程序相同，可以获得不同靶标基因对应的扩增曲线和扩增CT值。
7.一种用于活性结核分枝杆菌的定量检测的标准品，其特征在于：标准品的制备主要包括活性菌液的制备和标准品的制备；其中，
8.一种对活性结核分枝杆菌的定量检测方法，其特征在于：检测步骤包括：确定菌体浓度和拷贝浓度的定量关系、进行活性结核分枝杆菌的核酸检测和检测结果的定量分析；其中，
9.一种活性结核分枝杆菌的检测试剂盒，包括权利要求1-3任一项中所述的引物组合物、配套试剂、反转录酶、DNA聚合酶、阳性质控品和阴性对照，所述DNA聚合酶为增强型Tag酶。
10.权利要求1-3任一项中所述的引物组合物、权利要求4-6任一项中所述的对活性结核分枝杆菌的检测方法、权利要求7所述的用于活性结核分枝杆菌的定量检测的标准品、权利要求9所述的活性结核分枝杆菌的检测试剂盒，在制备活性结核分枝杆菌检测产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其特征在于：用于对活性结核分枝杆菌进行核酸检测，以mtb 16srrna为靶标基因的引物组合物包含反转录引物和特异性扩增引物，所述反转录引物包括标签引物的核苷酸序列和用于特异性反转录扩增mtb 16s rrna的核苷酸序列，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物；其中，
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述反转录引物的核苷酸序列为seq id no：1所示。
3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：以特异性扩增引物为基础进行qpcr扩增时，所述的引物组合物还包括对应的5’端都标记有荧光基团、3’端都标记有淬灭基团的探针。
4.一种对活性结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于：利用权利要求1-3任一项中所述的引物组合物对活性结核分枝杆菌进行核酸检测，以mtb 16s rrna为靶标基因分别进行反转录扩增和特异性扩增，所述反转录扩增包括步骤一和步骤二，所述特异性扩增为qpcr扩增；其中，
5.根据权利要求4所述的对活性结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于：所述反转录扩增和所述特异性扩增优选的反应条件包括：
【专利技术属性】
技术研发人员：高磊，杜江，李子涵，辛赫男，黄娟娟，郑丹丹，李洪智，曹雪芳，崔中锋，冯博轩，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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