用于中药农业自毒作用评价的方法技术

本发明专利技术是一种用于中药农业自毒作用评估的方法，通过仪器分析确定样品所含化学成分的种类及含量；在此基础上利用ＪＣ系数评价原植物的自毒作用评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否为药用植物化感作用的主导因子。该方法对于中药自毒作用的鉴定和评价中简单有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术为中药资源可持续发展的关键技术，具体涉及中药农业自毒作用评价方法。*
技术介绍
1中药材连作障碍及原因药用植物栽培中，存在一个突出问题，即随着栽培年龄的增加或栽培地的连作，植株生育不良，品质 和产量均大幅度下降。生产实践中发现，土壤环境恶化是药用植物栽培中普遍存在的问题，绝大多数根和 根茎类药材忌连作。如地黄连作引起严重病毒病，药材减产，同一块地在8~10年左右不能重茬；人 参栽种到5-6年后发病率急剧增加，而且连作障碍严重，老参地通常几十年不能重茬，等等。近年来，随 着栽培面积的不断扩大及中药材规范化种植(GAP)的推行，药用植物栽培中的土壤环境恶化及连作障碍 的危害日益突出。药用植物多为宿根植物，生长周期多为2年，几年甚至几十年。这与生长周期短的作物不同，土壤环 境恶化不仅表现为重茬，还表现为随栽培年龄增加出现的一系列土壤环境问题。对于多年生或连作药用植 物，由于耕作，施肥、灌溉等方式固定不变，会导致土壤理化性质恶化，肥力降低，有毒物质积累，有机 质分解缓慢，有益微生物种类和数量减少。因此，土壤环境恶化是药用植物栽培中无法回避的问题，不能 仅借助常规的轮作倒茬解决。而对药用植物次生代谢产物的追求加剧土壤环境恶化。引起植物连作障碍的原因主要有土壤养分失衡、土壤微生物群落结构改变、植物毒素物质增加及土壤 物理化学性质改变等。2药用植物自毒作用植物在生长发育过程中不断与根际土溶液进行着物质与能量的交换，通过各种途径(如地上部分淋溶、 根系分泌、植物残体分解等)进入根际区的源于植物自身的化学物质，直接影响着根际区土壤中微生物的 群落结构，微生物分解代谢又会产生新的化学物质，如此不断地影响和改变着根际区微生态生境，反过来 又对植物自身的生长发育产生影响。植物在长期适应环境的过程中，往往通过向环境释放化学物质来抑制 种内外其它植物的生长以提高其自身的生存竞争力，这种现象被称为化感作用(Allelopathy)。自毒现象 (autotoxicity)是化感作用的重要形式之一，它是指植物根分泌和残茬降解所释放出的次生代谢物，对自 身或种内其它植物产生危害的一种现象，它是植物适应种内竞争的结果，许多作物的连作障碍与此相关。 自毒作用是植物长期适应种内竞争的重要策略，在群体水平上实现了优胜劣汰，对物种的进化具有积极的 作用。但就栽培中药材而言，植物自毒造成的经济损失是显而易见的。因此，揭示自毒作用在药用植物连 作障碍中的地位具有重要意义。中药农业可采用间作套作制度、避免连作等手段来缓解甚至是克服中药的 自毒现象。近年来，通过遗传育种或转基因工程的手段和方法，筛选自毒作用小的品种引起人们的重视。3药用植物化感作用及自毒作用的研究方法自毒物质的提取分离和鉴定及其生物活性的检测是研究植物化感作用的基础，通常以待测样品的植物 部分，或者是与它相关的环境土壤作为提取源进行提取分离。药用植物自毒现象研究至今沿用化感作用研 究方法，缺少自己独特的方法学体系。尤其是在完成化学分离鉴定后，如何评价根际土与药材中所含次生 代谢产物的相似度，至今是个空白。*
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于中药农业自毒作用评估的方法。 本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。本专利技术所述的用于中药农业自毒作用评估的方法，具体包括如下步骤1)制备样品分别取原植物 根茎和根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后采用有机溶剂萃取，确定样品所含化学 成分的种类及含量；2)自毒物质相似性比较利用JC系数评价原植物的自毒作用JC=c/ (a+b+c) %， 公式中a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分数目，c为原植物根茎与根际土中3共有组分的数目；当JC大于5(W，表示有自毒作用存在，75%在自毒作用明显，大于90%有严重自毒作用。 通过种子发芽实验，在完成化感作用生物学检测的基础上，根据次生代谢指纹图谱的思路，使用不同 溶剂分别提取药材及根际土溶液，利用GC-MS、 HPLC-MS等化学分离鉴别手段，分别对药材及根际土所含 化学物质进行分离鉴别，结合本专利技术所用JC系数，评价药材及根际土的相似性，从而确定植物自毒是否 为药用植物化感作用的主导因子。JC为JC=c/ (a+b+c) %, a为药材中特有组分数目，b为根际土中特有 组分数目，c为药材与根际土中共有组分的数目(a， b所代表组分归一化百分含量大于iy。， c所代表两个 共有组分中至少有一个的归一化百分含量大于>1%)。* 附图说明图1不同浓度苍术根茎及根际土提取液对苍术种子发芽率、胚根长及胚芽长的影响 I代表误差线 图2苍术根茎及根际土乙醚及乙酸乙酯萃取液GC-MS色谱图 aa根茎乙醚萃取液，sa根际土乙醚粗 取液，ae根茎乙酸乙酯萃取液，se根际土乙酸乙酯萃取液* 具体实施例方式下面的实施例将对本专利技术作进一步的解释，但是本专利技术并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以 任何方式限制本专利技术的范围，本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属 于本专利技术的范围。1自毒物质的提取和试样的制备自毒物质的提取和试样的制备即是化学分析的必要步骤，也是生物学分析的基础。根据自毒物质进人 环境的途径，常用水作为浸提溶剂在常温条件下提取。同时在化感作用的研究中不应使用研碎的植物材料， 因为在粉碎研磨过程中很多在自然条件下不释放的酶、氨基酸、无机盐和含氮物质也释放出来，也会使提取液的渗透势异常ra值发生变化。由于自毒物质具有浓度效应，同一种自毒物质在不同浓度下其作用的 程度及性质不同，浸提液的浓度应该在自然状态下可能的浓度范围内。如果将植物栽种在无菌水、培养液 或固体介质中，培养一段时间后，取培养液(基)收集根系分泌物进行分析。2化感作用的生物测定生物测定(bioassay)是植物化感研究非常重要的手段。根据研究对象特点和实验条件，可选用以下一 种或几种方法进行生物测定①种子萌发试验最常用的种子萌发实验是在大小合适的培养皿或三角瓶中 进行，将经挑选的种子放入含有不同浓度自毒物质的滤纸或琼脂上，在有合适光照和温度的培养箱中进行 培养。种子萌发的标准是胚根突破种皮l-2mm，萌发的时间根据植物的不同一般为l-7d，用种子萌发的百 分率来表示。为解释自毒物质对种子萌发的延缓作用，可以采用萌发指数(I)来定量，连续5d记录种子萌 发情况，I用如下方法计算:1 = 2 (5XX1+4XX2+3XX3+2XX4+1XX5)，式中X是指每隔24h萌发的种子 数；Xl = 24h记录的萌发数；X2 = 48h记录的萌发数，依次类推。②幼苗生长发育实验它指受体植物在 最初的生长发育、器官形成过程中的生物测定，逋常用胚根、下胚轴或胚芽鞘的伸长来表示，也可以通过 称量叶、茎、根的干质量(生物重)来衡量自毒物质作用的强弱。幼苗生长生物测定的敏感性一般比种子发 芽要好。③挥发性物质测定对于测定挥发性物质化感作用，可在密闭的容器中将植物材料或挥发性物质 放在底部和上部，将无盖的培养皿放在中间进行种子萌发实验，容器必须每天通气以保证足够的氧气供应。3自毒物质分离鉴定自毒物质的分离包括各种中药化学研究中常用的萃取法、色谱法等。当前，自毒物质化学鉴别应用最 多的为气质联用及液质联用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于中药农业自毒作用评估的方法，其特征在于包括以下步骤：１）制备样品：分别取原植物根茎和根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后采用有机溶剂萃取，确定样品所含化学成分的种类及含量；２）自毒物质相似性比较：利用ＪＣ系数评价原植物的自毒作用：ＪＣ＝ｃ／（ａ＋ｂ＋ｃ）％，公式中ａ为原植物根茎中特有组分数目，ｂ为原植物根际土中特有组分数目，ｃ为原植物根茎与根际土中共有组分的数目；当ＪＣ大于５０％，表示有自毒作用存在，７５％在自毒作用明显，大于９０％有严重自毒作用。

【技术特征摘要】
1.一种用于中药农业自毒作用评估的方法，其特征在于包括以下步骤1)制备样品分别取原植物根茎和根际土样品适量，蒸馏水浸泡，离心沉淀，上清液抽滤后采用有机溶剂萃取，确定样品所含化学成分的种类及含量；2)自毒物质相似性比较利用JC系数评价原植物的自毒作用JC＝c/(a+b+c)％，公式中a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分数目，c为原植物根茎与根际土中共有组分的数目；当JC大于50％，表示有自毒作用存在，75％在自毒作用明显，大于90％有严重自毒作用。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于a为原植物根茎中特有组分数目，b为原植物根际土中特有组分 数目，c为原植物根茎与根际土中共有组分的数目。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于a， b所代表组分归一化百分含量大于1%, c所代表两个共有组分 中至少有一个的归一化百分含量大于》1%。4. 如权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭兰萍，黄璐琦，林淑芳，吴志刚，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]