【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料，具体涉及一种基于噬菌体磁性材料捕获和释放循环肿瘤细胞的方法。
技术介绍
1、循环肿瘤细胞(circulation tumor cell，ctc)，是由癌细胞从原发肿瘤组织脱落到血液循环中造成肿瘤循环扩散的肿瘤细胞，携带了与癌症的诊断、治疗有关的重要信息，因此可作为癌症早期诊断的重要标志物。然而，ctc在全血中的数量极少，在1ml全血中有数十亿的红细胞和数百万的白细胞，仅有几个到几十个ctc。同时ctc在不同肿瘤或同一肿瘤的不同位置还具有较强的异质性，这都为癌症早期检测富集ctc的平台带来了巨大困难。因此，高效富集、特异性检测以及高纯度捕获ctc是癌症早期诊断的关键。
2、近年来，基于抗体偶联磁性纳米材料广泛应用于全血中ctc的捕获。然而，抗体分子作为细胞标志物分子种类数量极少，常用的抗上皮细胞粘附分子(epcam)抗体也受限于细胞的异质性而影响对ctc的识别和富集。而核酸适配体作为一种新型识别分子与靶标分子具有亲和力高，体积小，识别蛋白种类多和稳定性好等优点，有着作为抗体替代识别配体的巨大潜力。因此，如何以合适的方法修饰适配体实现高效捕获和释放是当前对循环肿瘤细胞研究的热点问题。
3、基于抗原-抗体特异性结合的免疫分离是实现全血中ctc特异性富集的有效方法。其中，epcam抗体修饰的磁珠分离ctc具有较高的重复性，是目前唯一通过了美国fda认证的ctc检测技术。但遗憾的是，由于ctc在上皮-间质过程中细胞表面的epcam表达下降，导致此方法ctc富集效率和纯度不高。因而许多人致力于
4、传统的适配体捕获细胞的磁性材料是基于适配体直接连接到材料表面用于捕获ctc。然而无序排列的适配体往往只能对可及的ctc表面实现特异性的单价识别并捕获，这极大地影响了对ctc的捕获性能。同时适配体在材料表面的局部空间拥挤效应阻碍了释放分子作用靶向位点的可及性，降低了细胞的释放效率，从而严重影响了对ctc的下游分析。因而急需一种新型的ctc捕获亲和材料用于ctc高效富集和释放。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于噬菌体磁性材料捕获和释放循环肿瘤细胞的方法，所述噬菌体磁性材料具体为一种m13噬菌体磁性材料。
2、本专利技术的目的采用以下技术方案实现：
3、m13噬菌体偶联muc1适配体，即使epcam阴性表达也能捕获到靶标细胞，基于m13噬菌体磁性材料能够在临床实际乳腺癌样本中实现捕获和不同亚型的区分。基于协同m13噬菌体pviii蛋白多价展示和灵活摆动的特点，在2700个pviii蛋白拷贝提供了足够的反应位点供数百个结合配体，同时m13噬菌体的灵活性使其可以自由扭曲调整配体构型，自适应靶受体在细胞表面的分布模式，从而大大增强了其与ctc的多价相互作用。此外，噬菌体的摆动性更有利于dnase i酶接触适配体增加ctc的释放。
4、本专利技术以m13噬菌体为支架，piii蛋白噬菌体展示组氨酸用于连接镍修饰的磁球，pviii蛋白多价展示muc1适配体(apt)用于捕获循环肿瘤细胞，通过加入dnase i酶来实现对捕获的细胞进行亲和释放。协同m13噬菌体pviii蛋白多价展示和灵活摆动的特点明显增强了对ctc的多价捕获和释放性能，同时连接muc1适配体实现epcam阴性细胞也能特异性捕获并实现不同乳腺癌细胞的分型。
5、一种m13噬菌体磁性材料的制备方法，步骤如下：
6、6his-m13噬菌体的制备：m13噬菌体在piii蛋白的n端通过在m13ke载体的acc65i和eagi两个限制位点之间插入编码hhhhhh的短序列来展示6his标签。两个合成的磷酸化寡核苷酸链6h-psa1(5’-gtacctttctattctcactctcatcatcatcatcatcattcctccaaactgcagtc-3)和6h-psa2(5’-ggccgactgcagtttggaggaatgatgatgatgatgatgagagtgagaatagaaag-3)经过90～100℃，2～10min退火杂交，得到末端的双链dna 6h-psa，用于连接。m13ke载体用acc65i和eagi进行酶切，并用凝胶纯化试剂盒纯化。用t4连接酶将6h-psa在4～20℃下连接到线性化的m13ke中过夜。用cacl2转化法将连接产物转入化学感受态宿主细胞。在含有iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)和x-gal的lb琼脂板上筛选噬菌体斑，并通过dna测序进行验证。
7、n3-m13的合成：取1～100μl滴度为1×1011pfu/ml～8×1013pfu/ml的6his-m13噬菌体溶于150～300μl 10～100mm的无菌pbs缓冲溶液中(ph 7～8)混匀，加入100～200μl 5～20mm的nhs-peg-n3溶液，均匀混合，放置于温度为0～37℃的摇床中反应10～24h。将反应后的溶液取出，利用超滤管除去多余的nhs-peg-n3试剂，得到n3-m13，并将其放置于0～15℃冰箱中备用。
8、m13-mb的制备：取1～5mg/ml ida-mbs存储液(指his-tag蛋白纯化磁珠(镍离子)ida-nickel)，用5～20mm pbst(ph 6～8，含0.05～5％ bsa，0.01～0.5％tween-20)缓冲溶液洗三次，磁分离后重悬在pbst溶液中。加入纯化的1×109pfu～1×1012pfu n3-m13溶液均匀混合后放置于混匀仪下反应30min～12h。将反应后的产物磁性分离，并用pbst缓冲液清洗两次并重悬，得到m13-mb，并将其放置于0～15℃冰箱中备用。
9、apt-m13-mb：muc1适配体(5’-tttttgcagttgatcctttggataccctgg-3’，dbco修饰)用te缓冲溶液(5～20mm tris-hcl,0.5～2mm edta,ph 7～9)稀释得到10μm，取1～50μl上述适配体溶液用pcr仪器退火后加入到上述m13-mb中，在摇床中20～40℃反应2～10h，通过磁分离得到产物apt-m13-mb，即为m13噬菌体磁性材料。
10、一种m13噬菌体磁性材料，由上述制备方法制得。
11、本专利技术还提供一种m13噬菌体磁性材料的如下所述应用。
12、所述的一种m13噬菌体磁性材料在捕获和释放循环肿瘤细胞中的应用。
13、所述的一种m13噬菌体磁性材料在实际的乳腺癌患者血样中能够实现对循环肿瘤细胞的高效捕获，同时能够区分乳腺癌的不同分子分型，因此在制备乳腺癌样本中实现癌细胞的捕获和区分不同亚型乳腺癌的诊断组合物方面的应用。
14、所述的一种m13噬菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种M13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种M13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于所述N3-M13的合成步骤中，将1～100μL滴度为1×1011pfu/mL～8×1013pfu/mL的6His-M13噬菌体溶于150～300μL 10～100mM的无菌pH 7～8PBS缓冲溶液中混匀，加入100～200μL 5～20mM的NHS-PEG-N3溶液，均匀混合。
3.根据权利要求1所述的一种M13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于所述M13-MB的制备步骤中，取1～5mg/mL IDA-MBs存储液，用5～20mM PBST缓冲溶液洗三次，磁分离后重悬在PBST溶液中；加入纯化的1×109pfu～1×1012pfu N3-M13溶液；所述PBST缓冲溶液pH6～8，含0.05～5％BSA，0.01～0.5％tween-20。
4.根据权利要求1所述的一种M13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于所述M13-MB的制备步骤中，IDA-MBs存储液是指His-Tag蛋白纯化镍离子磁珠。
...【技术特征摘要】
1.一种m13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
2.根据权利要求1所述的一种m13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于所述n3-m13的合成步骤中，将1～100μl滴度为1×1011pfu/ml～8×1013pfu/ml的6his-m13噬菌体溶于150～300μl 10～100mm的无菌ph 7～8pbs缓冲溶液中混匀，加入100～200μl 5～20mm的nhs-peg-n3溶液，均匀混合。
3.根据权利要求1所述的一种m13噬菌体磁性材料的制备方法，其特征在于所述m13-mb的制备步骤中，取1～5mg/ml ida-mbs存储液，用5～20mm pbst缓冲溶液洗三次，磁分离后重悬在pbst溶液中；加入纯化的1×109pfu～1×1012pfu n3-m13溶液；所述pbst缓冲...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。