【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及了细胞分化，具体涉及了一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法。
技术介绍
1、心脏传导系统(cardiac conduction system，ccs)的高度协调是引导哺乳动物心脏产生有序收缩的基础。哺乳动物成熟的ccs包含窦房结(sinoatrial node,san)、房室结(atrioventricularnode,avn)、房室束和心室传导网络。研究表明，san细胞具有最高的自动性，是心脏主要的起搏位点，为心脏每一次协调收缩提供主要的电刺激。san发育和功能紊乱导致病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,sss)。sss通常发生在老年人中，其患病率在我国持续上升。仅在美国每年就有超过35万例起搏器手术，其中因窦房结功能障碍而手术的患者占植入手术的一半以上。
2、目前对有症状的sss患者的治疗主要依靠植入式电子起搏器和对症治疗，缺乏针对病因的根本治疗。目前体外通过诱导多能干细胞已成功分化出具有窦房结样表型的起搏细胞。然而，目前大多数研究都是围绕心房、心室和窦房结样心肌细胞的混合群体进行的，且心肌细胞的体外诱导方案中的窦房结样细胞的分化比例极低，心肌细胞的混合亚型可能会改变疾病的表型，并影响移植细胞在体内的预后情况。目前缺乏针对窦房结样细胞的体外分化方法，研究出一种能提高窦房结样细胞单一亚群心肌细胞的体外分化比例的方法，具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种体外诱导胚胎干细
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、bmp信号选择性抑制剂和bmp信号激活剂同时在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。
4、研究发现，在hescs向心肌细胞定向分化过程中，单向抑制或激活bmp信号通路均能在体外促进窦房结样细胞的富集，但是通过针对性的研究发现，时序性、双向调控bmp信号通路显著促进了hescs向窦房结样细胞分化，能在体外高效获取具有窦房结电生理特性的起搏细胞。在分化早期选择性抑制bmp信号通路，接着激活bmp信号通路能显著增强诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，极大地抑制了心房肌、心室肌的表达但同时也在一定程度上增加了房室结和非心肌细胞基因的表达。实验探究发现，双向调控bmp信号(bd)显著增强了诱导生成的细胞中窦房结基因的表达，同时极大地抑制了心房肌、心室肌的表达；双向调控bmp信号(bd)还显著增加了nkx2.5-/ctnt+细胞(窦房结样细胞)的生成比例；免疫荧光染色证明相比于giwi组，bd组显著上调了tbx3+/ctnt+、shox2+/ctnt+、tbx18+/ctnt+和nkx2.5-/ctnt+的比例。
5、进一步的，bmp信号选择性抑制剂为dmh1；和/或，bmp信号激活剂为bmp4重组蛋白。
6、进一步的，bmp信号选择性抑制剂的使用时间为诱导定向分化的第4-6天；bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2-3μm，优选地，bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2.5μm。
7、进一步的，bmp信号激活剂的使用时间为诱导定向分化的第7-9天；bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.5-1ng/ml，优选地，bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.625ng/ml。
8、本专利技术的另一目的是为了提供一种诱导分化培养基。
9、既往对窦房结样细胞的体外诱导方法的研究主要包括基因重编程诱导法、共培养诱导法和非基因修饰的信号通路诱导法。已有大量研究报道基因重编程诱导法可以实现干细胞甚至工作心肌细胞向窦房结样细胞的分化，并据此成功构建了具有起搏功能的生物起搏器；但是，通过基因重编程获得的窦房结样细胞的安全性却受到了极大质疑。另外，将干细胞与窦房结组织块或内胚层祖细胞共培养的条件诱导法虽然能成功诱导出具备电生理特性的窦房结样细胞，并在一定程度上避免了基因重编程带来的诸多弊端；但该方法在窦房结样细胞诱导稳定性和分化效率上的提升空间很小，很难实现在体外稳定、大量地获取高质量、高纯度的窦房结样细胞用于后续应用。
10、目前使用的单层贴壁心肌细胞分化方法是基于rpmi1640基础培养基混合“b27”添加剂的体系(“b27”添加剂是由21种成分组成的复杂混合物，包括许多动物来源的未知蛋白)，目前尚不清楚“b27”添加剂中的未知成分是否会影响窦房结样细胞在体外分化的效率、成熟度以及稳定性。
11、一种诱导分化培养基，诱导分化培养基包括分化完全培养基i、分化完全培养基ii、dmh1工作液、分化完全培养基iii和bmp4重组蛋白工作液；
12、其中，分化完全培养基i包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa 2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白和5μm chir99021；
13、分化完全培养基ii包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白和2μm wnt-c59；
14、分化完全培养基iii包括：rpmi 1640基础培养基,500μg/ml l-抗坏血酸2-磷酸(aa 2-p)，213μg/ml牛血清白蛋白；
15、dmh1工作液为包括质量浓度为2.5μm dmh1的分化完全培养基iii；
16、bmp4重组蛋白工作液为包括质量浓度为0.625ng/ml bmp4重组蛋白的分化完全培养基iii。
17、本专利技术提供了一种诱导分化培养基，包括分化完全培养基i、分化完全培养基ii、dmh1工作液、分化完全培养基iii和bmp4重组蛋白工作液；基于化学成分明确的分化培养基(包含基础培养基rpmi1640、l-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白)在体外能够成功分化出高达95％的心肌细胞。该诱导分化培养基，成分明确，具有简便、高效、稳定、重复性高等优点，有效克服了体外诱导方法需要添加多种外源性未知蛋白，分化存在不稳定和效率低的缺点。本专利技术的又一目的是为了提供诱导分化培养基的应用。
18、本专利技术基于化学成分明确的分化培养基(包含基础培养基rpmi1640、l-抗坏血酸2-磷酸和水稻衍生的重组人白蛋白)在体外能够成功分化出高达95％的心肌细胞。与拟胚体诱导体系和含“b27”添加剂的培养体系相比，该心肌细胞基础分化方案没有添加过多的细胞因子和未知动物源性蛋白，具有高效、稳定等优点，可作为在体外模拟心脏胚胎发育的理想模型。这为我们在体外开发针对窦房结样细胞的分化方法提供了基础。
19、上述的诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。
20、本专利技术的另一目的是为了提供一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法。
21、一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.BMP信号选择性抑制剂和BMP信号激活剂同时在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，BMP信号选择性抑制剂为DMH1；和/或，BMP信号激活剂为BMP4重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，BMP信号选择性抑制剂的使用时间为诱导定向分化的第4-6天；BMP信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2-3μM，优选地，BMP信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2.5μM。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，BMP信号激活剂的使用时间为诱导定向分化的第7-9天；BMP信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.5-1ng/ml，优选地，BMP信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.625ng/ml。
5.一种诱导分化培养基，其特征在于，诱导分化培养基包括分化完全培养基I、分化完全培养基II、DMH1工作液、分化完全培养基III和BMP4重组蛋白工作液；
6.如权利要求5所述的诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细
7.一种体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的体外诱导胚胎干细胞定向分化窦房结样细胞的方法，其特征在于，胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
9.一种对分化成的窦房结样细胞的纯化培养基，其特征在于，包括纯化完全培养基I和纯化完全培养基II；
10.利用权利要求9所述的纯化培养基进行纯化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.bmp信号选择性抑制剂和bmp信号激活剂同时在诱导胚胎干细胞体外定向分化窦房结样细胞中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bmp信号选择性抑制剂为dmh1；和/或，bmp信号激活剂为bmp4重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bmp信号选择性抑制剂的使用时间为诱导定向分化的第4-6天；bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2-3μm，优选地，bmp信号选择性抑制剂在诱导分化培养基中的质量浓度为2.5μm。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，bmp信号激活剂的使用时间为诱导定向分化的第7-9天；bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质量浓度为0.5-1ng/ml，优选地，bmp信号激活剂在诱导分化培养基中的质...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖斌，万居易，侯晓杰，凡伟，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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