【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物，尤其涉及一种工程化微生物及其在微生物细胞或代谢产物生产中的应用。
技术介绍
1、在微生物发酵过程中，微生物细胞的生长和生物量的积累往往是影响代谢产物生产性能的关键因素，而很多微生物在生物量积累至一定程度后，开始进入生长平台期，生长速率大幅降低，这也成为很多代谢产物无法持续高效合成和积累的限制因素。
2、微生物往往通过释放小分子物质在细胞之间进行交流，并且在达到临界数量后会发出通告，这种小分子物质被称为群感效应分子。然而关于群感效应分子如何影响微生物发酵过程中的生物量积累和产物合成的研究报道在盐单胞菌中仍较少。如何突破微生物的生长和生物量积累限制以提升产物的合成效率仍是目前亟需解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种工程化微生物及其在微生物细胞或代谢产物生产中的应用。
2、盐单胞菌在发酵过程中当菌体密度达到一定程度后，菌体无法进一步向更高密度增殖，生长期较短，限制了发酵密度和生物量的上限。本专利技术在盐单胞菌的发酵过程中发现，上述发酵密度和生物量的限制主要是由于群感效应分子的存在导致的。在盐单胞菌中，群感效应分子是高丝氨酸内酯（ahl），这种小分子在群感效应中发挥重要作用，也正是由于群感效应分子高丝氨酸内酯的存在，导致盐单胞菌的发酵密度无法突破现有限制，各种代谢产物的产量也因此受到制约，很难从增加生物量的角度提高代谢产物的产量。本专利技术进一步发现，将高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编
3、具体地，本专利技术提供以下所述的技术方案。
4、第一方面，本专利技术提供高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在提高微生物的生物量和/或代谢产物的生产性能中的应用；所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。
5、第二方面，本专利技术提供高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在选育具有提高的生物量和/或代谢产物的生产性能的微生物中的应用；所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。
6、本专利技术中，所述生物量是指发酵制得微生物细胞的重量（优选为干重，也可用发酵液的吸光度表征生物量）。
7、所述代谢产物为其合成速率与微生物生长速率偶联或部分偶联的代谢产物。
8、优选地，所述代谢产物包括选自聚酯、蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸或其衍生物、有机酸或其衍生物中的一种或多种。
9、进一步优选地，所述代谢产物为pha。
10、所述代谢产物的生产性能包括代谢产物的产量、转化率和/或生产强度。其中，所述转化率为目标产物相对于发酵底物的转化率；所述生产强度为单位时间内的目标产物产量。
11、本专利技术中，所述微生物为细菌或真菌。优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌。
12、作为示例，所述盐单胞菌为盐单胞菌（ halomonas bluephagenesis）或盐单胞菌（ halomonas campaniensis）。
13、本专利技术中，对于实现 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低的技术手段没有特殊限制，例如，可采用常用的基因工程手段和基因编辑方法对所述基因、其编码蛋白、其调控元件或调控蛋白进行修饰，以使得 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。
14、示例性地，所述基因的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过以下（1）~（3）中的任意一种或多种方式的组合实现：
15、（1）对蛋白的氨基酸序列进行突变；
16、（2）对基因的核苷酸序列进行突变；
17、（3）将基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件。
18、以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个氨基酸。
19、以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、插入或替换一个或多个核苷酸。
20、以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
21、优选地，所述高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过失活高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts实现。
22、优选地，所述失活通过敲除实现。
23、本专利技术中，微生物的选育可采用基因工程改造、诱变、适应性进化等方法。
24、第三方面，本专利技术提供一种产pha的工程化微生物，所述微生物中高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。
25、优选地，所述微生物为细菌或真菌。优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌。
26、作为示例，所述盐单胞菌为盐单胞菌（ halomonas bluephagenesis）或盐单胞菌（ halomonas campaniensis）。
27、优选地，所述微生物中，高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts失活。
28、所述基因失活可通过对所述基因进行一个或多个核苷酸的插入、缺失或替换的方式实现。优选地，所述基因失活通过基因敲除实现。
29、优选地，所述高丝氨酸内酯合成酶的氨基酸序列为seq id no.1所示序列编码的氨基酸序列。
30、优选地，所述工程化微生物的生物量和/或pha生产性能因高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低而提高。
31、对于所述产pha的工程化微生物的出发菌株，本专利技术没有特殊限制，可为任意具有pha合成能力且含有高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的细菌（优选为嗜盐菌，更优选为盐单胞菌）。本专利技术通过在多株盐单胞菌中进行验证，确定了高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低的改造策略在盐单胞菌中具有普适性，不依赖于出发菌株的特定遗传背景；通过降低高丝氨酸内酯合成酶基因 hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性，不同盐单胞菌在氮源等营养物质供应充足的发酵条件下，生物量均显著提升，pha的产量也均显著提升。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在提高盐单胞菌的生物量和/或PHA的生产性能中的应用；
2.高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在选育具有提高的生物量和/或PHA的生产性能的盐单胞菌中的应用；
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过失活高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS实现。
4.一种产PHA的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌中高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。
5.根据权利要求4所述的产PHA的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌中，高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS失活；
6.根据权利要求4或5所述的产PHA的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌的生物量和/或PHA生产性能因高丝氨酸内酯合成酶基因hdtS的表达量和/或其编码蛋白的活性降低而提高。
7.一种PHA的生产方法，其特征在于，所述方法包括：对权利要求4~6任一项所述
8.根据权利要求7所述的PHA的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养过程中，在菌体生长阶段给予充足的碳源和氮源。
9.根据权利要求7或8所述的PHA的生产方法，其特征在于，在发酵8-24小时以流加补料的方式向发酵体系中补充氮源；
10.根据权利要求9所述的PHA的生产方法，其特征在于，在发酵8-24小时向发酵体系中流加包含质量比为（0.03-0.07）：1的氮源和碳源的补料液，补料液的流加速率以维持发酵体系中碳源的含量为5-15g/L为准；在发酵24小时以后，向发酵体系中流加碳源以维持发酵体系中碳源的含量为5-15g/L；
...【技术特征摘要】
1.高丝氨酸内酯合成酶基因hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在提高盐单胞菌的生物量和/或pha的生产性能中的应用；
2.高丝氨酸内酯合成酶基因hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低在选育具有提高的生物量和/或pha的生产性能的盐单胞菌中的应用；
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述高丝氨酸内酯合成酶基因hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低通过失活高丝氨酸内酯合成酶基因hdts实现。
4.一种产pha的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌中高丝氨酸内酯合成酶基因hdts的表达量和/或其编码蛋白的活性降低。
5.根据权利要求4所述的产pha的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌中，高丝氨酸内酯合成酶基因hdts失活；
6.根据权利要求4或5所述的产pha的工程化盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌的生物量和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：张李湛，徐绚明，刘威，
申请(专利权)人：北京微构工场生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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