【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种核酸构建体及其用途。
技术介绍
1、基因组整合作为基础和应用生物学研究中重要的工具，要求将功能性的dna片段精确而稳定的插入宿主生物的基因组中。与把目的基因构建到质粒上保存相比，将异源基因整合到大肠杆菌基因组的特定位置中储存，可以有效减轻宿主生物代谢负担，并提供遗传稳定性。由此产生的重组菌株作为生物学工具应用于科学研究中则更加便利、稳定。
2、伴随着合成生物学的发展，噬菌体整合酶重组系统得到了广泛研究并被用作基因编辑的工具。噬菌体整合酶是介导两个dna识别序列(噬菌体附着位点attp和细菌附着位点attb)之间的单向位点特异性重组的酶。基于它们的催化模式，可将整合酶分为两个主要家族，即酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶。酪氨酸家族整合酶如λ整合酶利用催化酪氨酸来介导链切割，倾向于识别更长的attp序列，并且需要由噬菌体或宿主细菌编码的其它蛋白质。丝氨酸家族的噬菌体整合酶更大，使用催化丝氨酸用于链切割，识别更短的attp序列，并且不需要宿主辅因子。丝氨酸整合酶通过催化其特异性识别dna序列(attb和attp)发生精确重排而实现位点特异性基因重组。利用该原理实现外源基因的基因组整合，这要求基因组的特定位置和外源基因所在质粒同时含有整合酶的识别序列。因此需要一个载体质粒，具备所需整合酶识别序列，并将外源基因插入到其中，最终构建的含有外源基因的质粒，才能在丝氨酸整合酶的作用下完成其在基因组上的整合。
3、按照传统的构建质粒的流程“pcr扩增片段→产物回收→片段重组→转化→筛选→提取质粒
4、ccdb是一段位于大肠杆菌f质粒上的基因，可以表达一种毒性蛋白——dna促旋酶抑制剂，锁定dna促旋酶和断裂的双链dna复合物，最终导致细胞死亡。目前此系统已经被运用到了“gateway cloning”之中。在筛选平板上，未插入目的基因的空载体质粒的存在是假阳性菌落出现的原因。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种核酸构建体及其用途。
2、本专利技术的目的之一在于提供一种核酸构建体，包含ccdb-coleⅰ序列，还包含第一位点特异性重组酶的attb序列或attp序列、第二位点特异性重组酶的attb序列或attp序列以及第三位点特异性重组酶的attb序列和attp序列。
3、优选的，所述ccdb-coleⅰ序列自5’端到3’端依次含有ccdb和coleⅰ序列。
4、优选的，所述ccdb-coleⅰ序列两端设有同源重组用同源臂。
5、更优选的，所述ccdb序列包括如seq id no.7所示序列。
6、更优选的，所述coleⅰ序列包括如seq id no.8所示序列。
7、优选的，所述位点特异性重组酶选自丝氨酸重组酶。
8、更优选的，所述丝氨酸重组酶选自tp901-1、bxb1和phic31中的一种或多种。
9、进一步优选的，tp901-1的识别序列选自attp 1序列和attb 1序列，bxb1的识别序列选自attp 2序列和attb 2序列，phic31的识别序列选自attp 3序列和attb 3序列。
10、更进一步优选的，所述attb 1序列包括如seq id no.1所示序列。
11、更进一步优选的，所述attb 2序列包括如seq id no.2所示序列。
12、更进一步优选的，所述attb 3序列包括如seq id no.3所示序列。
13、更进一步优选的，所述attp 1序列包括如seq id no.4所示序列。
14、更进一步优选的，所述attp 2序列包括如seq id no.5所示序列。
15、更进一步优选的，所述attp 3序列包括如seq id no.6所示序列。
16、优选的，所述第一位点特异性重组酶的attp序列和第三位点特异性重组酶的attp序列各自独立的选自attp 1序列、attp 2序列、attp 3序列。
17、优选的，所述第二位点特异性重组酶的attb序列和第三位点特异性重组酶的attb序列各自独立的选自attb 1序列、attb 2序列、attb 3序列。
18、优选的，所述核酸构建体依次含有第一位点特异性重组酶的attb序列或attp序列、ccdb-coleⅰ序列、第二位点特异性重组酶的attb序列或attp序列、以及第三位点特异性重组酶的attb序列和attp序列，其中，第一位点特异性重组酶和第二位点特异性重组酶不能同时为attb序列或attp序列。
19、更优选的，所述核酸构建体依次含有attp 1序列、ccdb-coleⅰ序列、attb 3序列、attp 2序列、筛选标记基因和attb 2序列。
20、更优选的，所述核酸构建体依次含有attp 3序列、ccdb-coleⅰ序列、attb 1序列、attp 2序列、筛选标记基因和attb 2序列。
21、优选的，所述核酸构建体的筛选标记基因位于第三位点特异性重组酶的attb序列和attp序列之间。
22、更优选的，所述筛选标记为抗性基因。
23、优选的，所述核酸构建体为表达载体，所述ccdb-coleⅰ序列、第一位点特异性重组酶的attb序列或attp序列、第二位点特异性重组酶的attb序列或attp序列以及第三位点特异性重组酶的attb序列和attp序列位于所述表达载体的表达框架中。
24、更优选的，所述核酸构建体的骨架选自pkd4。
25、更优选的，所述核酸构建体的序列如seq id no.9所示序列或如seq id no.10所示序列。
26、本专利技术的目的之二在于提供一种重组系统，所述重组系统包含载体质粒、表达第一位点特异性重组酶的质粒和/或表达第二位点特异性重组酶的质粒、以及表达第三位点特异性重组酶的质粒，其中，所述载体质粒为如上文所述的核酸构建体。
27、优选的，所述重组系统还包含供体质粒，所述供体质粒包含目的基因。
28、优选的，所述重组系统至少含有两种不同的载体质粒以便于在基因组上循环整合外源基因。
29、本专利技术的目的之三在于提供一种重组细胞，由带目的基因的重组载体与表达位点特异性重组的质粒导入宿主细胞获得，其中，所述带目的基因的重组载体由上文所述的重组系统中载体质粒和目的基因重组获得的。
30、本专利技术的目的之四在于提供如上文所述的核酸构建体或如上文所述的重组系统用于基因组整合或基因重组或基因编辑中的用途。
31、本专利技术的目的之五在于提供一种基因组整合或基因重组或基因编辑的方法，将目的基因与如上文所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其特征在于，包含CcdB-ColEⅠ序列，还包含第一位点特异性重组酶的attB序列或attP序列、第二位点特异性重组酶的attB序列或attP序列以及第三位点特异性重组酶的attB序列和attP序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
4.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述attB 1序列包括如SEQ ID NO.1所示序列；
5.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体依次含有attP 1序列、CcdB-ColEⅠ序列、attB 3序列、attP 2序列、筛选标记基因和attB 2序列；
6.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的骨架选自pKD4。
7.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的序列如SEQ IDNO.9所示序列或如SEQ ID NO.10所示序列。
8.一种重组系统，其特征在
9.如权利要求8所述的重组系统，其特征在于，所述重组系统至少含有两种不同的载体质粒以便于在基因组上循环整合外源基因。
10.一种重组细胞，其特征在于，由带目的基因的重组载体与表达位点特异性重组的质粒导入宿主细胞获得，其中，所述带目的基因的重组载体由如权利要求8所述的重组系统中载体质粒和目的基因重组获得。
11.如权利要求1-7任一项所述的核酸构建体或如权利要求8所述的重组系统用于基因组整合或基因重组或基因编辑中的用途。
12.一种基因组整合或基因重组或基因编辑的方法，其特征在于，将目的基因与如权利要求1-7任一项所述的核酸构建体重组获得重组载体，在位点特异性重组酶的作用下，进行基因组整合或基因重组或基因编辑。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其特征在于，包含ccdb-coleⅰ序列，还包含第一位点特异性重组酶的attb序列或attp序列、第二位点特异性重组酶的attb序列或attp序列以及第三位点特异性重组酶的attb序列和attp序列。
2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：
4.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述attb 1序列包括如seq id no.1所示序列；
5.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体依次含有attp 1序列、ccdb-coleⅰ序列、attb 3序列、attp 2序列、筛选标记基因和attb 2序列；
6.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的骨架选自pkd4。
7.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的序列如seq idno.9所示序列或如seq id no.10所示序列。
8.一种重组系统，其...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。