【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，特别是涉及一种生产l-精氨酸的大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、l-精氨酸(l-arginine)是一种人体半必需氨基酸，其在生物体内具有重要的生理功能，如调节激素分泌、治疗心血管疾病、促进生殖系统发育、提高免疫力等，因而在医疗保健、食品、化妆品及饲料等行业中商业价值显著。
2、目前，l-精氨酸的生产方法主要有蛋白水解法、化学合成法和微生物合成这三种方法。毛发、猪皮明胶等含有丰富的l-精氨酸，可以作为原料利用水解法来制备l-精氨酸。但蛋白质水解法不仅产量低、操作复杂，还容易污染环境。l-精氨酸的化学合成是一个比较复杂的过程，会产生有毒物质污染环境。相对于化学合成的方法，微生物合成l-精氨酸不仅效益高、环境友好、生产过程稳定，而且发酵合成的产品纯度高、基本无毒副作用，被认为是最具吸引力的方法。
3、微生物合成法生产l-精氨酸主要包括传统诱变技术和基因工程技术。关于传统诱变育种方面已经有大量的研究工作，但该技术需要的工作量大、随机性高，存在遗传稳定性差，容易产生回复突变等缺点很难投入到大批量工业生中。基因工程技术则是通过理性改造微生物的代谢途径从而获得目标产物高产的重组工程菌株。
4、l-精氨酸的合成是以l-谷氨酸为底物，通过线性途径、循环途径及新发现途径等三种合成途径，含有7～8步酶促反应催化生成。大肠杆菌由于生长周期短、代谢途径清晰、分子操作便捷等优势，目前被作为氨基酸生产的主要菌株之一。本专利技术拟开发一种生产l-精氨酸的大肠杆菌，从而为发酵生产l-精氨酸提
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种生产l-精氨酸的大肠杆菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本专利技术通过在大肠杆菌bl21中异源表达argg基因，构建得到了生产l-精氨酸的大肠杆菌，可以提高l-精氨酸的生物合成水平，从而为发酵生产l-精氨酸提供技术支持。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种生产l-精氨酸的大肠杆菌的构建方法，包括将精氨琥珀酸合成酶基因导入大肠杆菌出发菌株，构建得到过表达所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组菌株的步骤，所述重组菌株即为所述生产l-精氨酸的大肠杆菌。
4、进一步地，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5、进一步地，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、进一步地，所述大肠杆菌出发菌株为大肠杆菌bl21。
7、进一步地，通过将含所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组质粒转化入所述大肠杆菌出发菌株，来构建得到所述重组菌株。
8、进一步地，通过pt7启动子调控所述精氨琥珀酸合成酶基因的表达。
9、本专利技术还提供一种根据上述的构建方法构建得到的生产l-精氨酸的大肠杆菌。
10、本专利技术还提供上述的生产l-精氨酸的大肠杆菌在发酵生产l-精氨酸中的应用。
11、本专利技术还提供一种发酵生产l-精氨酸的方法，包括对上述的生产l-精氨酸的大肠杆菌进行发酵培养的步骤。
12、进一步地，所述发酵培养的培养基包括以下组分：葡萄糖20-40g/l、蛋白胨2-10g/l、k2hpo42-3 g/l、葡萄糖酸钠1-2g/l、k2so4·7h2o 2-3g/l、feso4·7h2o 10-20mg/l、胆碱10-20mg/l、维生素b1(vb1)1-3mg/l、维生素b3(vb3)1-3mg/l、维生素b5(vb5)1-3mg/l、维生素b12(vb12)1-3mg/l和维生素h(vh)1-3mg/l，ph7.0-7.2；
13、所述发酵培养的条件为：发酵温度为33-37℃，通过补糖控制二氧化碳释放速率为105±16mmol/l/h，同时发酵液中残留葡萄糖浓度控制在0.3±0.2g/l。
14、本专利技术公开了以下技术效果：
15、本专利技术研究发现在大肠杆菌的l-精氨酸代谢途径中，精氨琥珀酸合成酶(由argg基因编码)是关键的限速酶之一，该酶的高效表达可解除l-精氨酸合成途径反馈调控机制，实现菌株生长与l-精氨酸生产的平衡。本专利技术通过在大肠杆菌bl21中异源表达argg基因，构建得到了生产l-精氨酸的大肠杆菌，可以提高l-精氨酸的生物合成水平。其中，来源于stretococcus thermophilus的精氨琥珀酸合成酶基因argg在大肠杆菌bl21中的过表达可以显著提高l-精氨酸的生物合成水平，l-精氨酸积累浓度从54g/l提升到了108g/l，l-精氨酸的产率提高了50％。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种生产L-精氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括将精氨琥珀酸合成酶基因导入大肠杆菌出发菌株，构建得到过表达所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组菌株的步骤，所述重组菌株即为所述生产L-精氨酸的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌出发菌株为大肠杆菌BL21。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通过将含所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组质粒转化入所述大肠杆菌出发菌株，来构建得到所述重组菌株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，通过PT7启动子调控所述精氨琥珀酸合成酶基因的表达。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的构建方法构建得到的生产L-精氨酸的大肠杆菌。
8.一种如权利要求7所述的生产L-精氨酸的大肠杆菌在发酵生产
9.一种发酵生产L-精氨酸的方法，其特征在于，包括对权利要求7所述的生产L-精氨酸的大肠杆菌进行发酵培养的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基包括以下组分：葡萄糖20-40g/L、蛋白胨2-10g/L、K2HPO42-3 g/L、葡萄糖酸钠1-2g/L、K2SO4·7H2O 2-3g/L、FeSO4·7H2O 10-20mg/L、胆碱10-20mg/L、维生素B11-3 mg/L、维生素B31-3 mg/L、维生素B51-3 mg/L、维生素B121-3 mg/L和维生素H1-3mg/L。
...【技术特征摘要】
1.一种生产l-精氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括将精氨琥珀酸合成酶基因导入大肠杆菌出发菌株，构建得到过表达所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组菌株的步骤，所述重组菌株即为所述生产l-精氨酸的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述精氨琥珀酸合成酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌出发菌株为大肠杆菌bl21。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通过将含所述精氨琥珀酸合成酶基因的重组质粒转化入所述大肠杆菌出发菌株，来构建得到所述重组菌株。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，通过pt7启动...
【专利技术属性】
技术研发人员：王志敏，郑武勇，王锡磊，吕荣剑，桂铅，罗标，周思莹，
申请(专利权)人：杭州精构生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。