【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种诱导鱼类永生化肌肉干细胞干性恢复及其成肌分化的方法。
技术介绍
0、
技术介绍
：
1、由于环境污染、人口增加、水资源短缺等问题，使全球肉类的供应受到巨大挑战。为缓解肉类供应所面临的压力，许多研究人员将目光聚焦到植物和昆虫，并提倡用来自植物和昆虫的蛋白质来代替肉制品中的蛋白质。然而，由于合成肉在口感以及味道上和传统肉类还有较大差距，人工合成肉在使用上频频受限。为解决上述问题，细胞培养肉逐渐成为研究热点。细胞培养肉是指通过肌肉干细胞增殖和分化而获得的可食用肉。目前，一些研究人员和公司已将细胞培养肉视为潜在的蛋白质来源。
2、肌肉的再生包括不同的阶段：第一阶段是肌肉卫星细胞分化为成肌细胞；第二阶段这些增殖的成肌细胞退出细胞周期，排列并融合形成多核肌管，然后形成肌纤维。自首次以牛肌肉细胞为原料生产出培养肉以来，肌肉干细胞就因其优越的增殖分化性能被广泛用于细胞培养肉的生产。然而随着体外培养时间的增加，肌肉干细胞的干性也会显著下降，只有通过不断分离纯化新的种子细胞才能持续进行细胞培养肉的生产，而这无疑大大增加了细胞培养肉生产的成本。我们在前期研究中已经研制了能够满足鱼类肌肉干细胞永生化的代血清培养基。在此基础上，我们进一步专利技术了一种能够使永生化肌肉干细胞恢复干性并有效分化的方法。
技术实现思路
0、
技术实现思路
：
1、本专利技术要解决的技术问题是研发鱼类永生化肌肉干细胞快速分化的方法，使其成为解决细胞培养肉的规模化
2、为解决上述问题，本专利技术采用多种手段实验后，得到了一种可以使鱼类永生化肌肉干细胞恢复干性的培养基，在此基础上实现了鱼类永生化肌肉干细胞的干性恢复，进一步得到了快速分化的方法，为之后细胞培养肉的规模化生产提供了一种可行的办法。
3、为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种干细胞干性恢复培养基，包括以下成分：dmem/f12基础培养基、牛血浆提取物、tubastatin a和褪黑素。本专利技术中的dmem/f12基础培养基和牛血浆提取物属于无血清培养基成分，用于支持细胞正常生长；tubastatina和褪黑素在干性恢复中发挥作用，其中tubastatin a是一种强效特异性的hdac6小分子抑制剂，通过抑制hdac6促进细胞进入静息状态并帮助细胞适应无血清培养环境；褪黑素则具有增强pax7表达的能力。
4、进一步的，牛血浆提取物添加量为按体积比添加5％-10％，tubastatina的含量为100μm-300μm，褪黑素的含量为100μm-500μm，其余为dmem/f12基础培养基。其中，牛血提取物在该添加比例中能够保证细胞正常生长；tubastatina在100μm以下时，细胞进入静息状态的程度与tubastatina的添加量成正比，在100μm-300μm这一范围细胞进入静息的程度没有明显差异，超过300μm细胞开始死亡；褪黑素在100μm以下时对pax7的表达没有显著影响，在100μm-500μm时能有效提高pax7的表达，而超过500μm会导致细胞出现转分化的趋势。
5、上述培养基在诱导鱼类肌肉干细胞干性恢复中的应用。
6、一种利用上述干细胞干性恢复培养基诱导鱼类肌肉干细胞干性恢复及成肌分化的方法，包括以下步骤：
7、(1)将永生化鱼类肌肉干细胞接种到细胞培养板中，使细胞密度达到80％以上；
8、(2)吸去细胞培养基，用pbs润洗3遍，加入干细胞干性恢复培养基孵育24-48小时；
9、(3)吸去干性恢复培养基，用pbs润洗3遍，加入分化培养基继续培养，每隔3天更换新鲜的分化培养基，直至鱼类肌肉干细胞分化为成肌细胞，并相互融合形成肌管以及分化形成肌纤维。
10、应用本专利技术的干细胞干性恢复培养基，能够成功促进鱼类永生化肌肉干细胞的体外分化，解决了永生化鱼类肌肉干细胞因干性下降无法分化的问题。本专利技术中使用的肌肉干细胞为永生化细胞，由于长时间培养，细胞干性显著降低，需要通过干性恢复培养基激活细胞干性，再采用细胞分化培养基诱导细胞分化。
11、进一步的，所述分化培养基包括以下成分：dmem/f12基础培养基、牛血浆提取物、igf-1和胰岛素。目前成肌分化主要采取马血清诱导分化以及降低胎牛血清诱导分化，本专利技术中马血清会使细胞出现严重的空泡化；而大黄鱼肌肉干细胞虽然能够通过干性恢复培养基使细胞干性得到恢复，但无法恢复到原有水平，通过降低胎牛血清含量诱导分化的效果不理想，需要添加igf-1和胰岛素促进分化。igf-1和胰岛素可作用于细胞的igf-1受体，通过pi3k-akt信号通路诱导细胞成肌分化。。
12、进一步的，牛血浆提取物按体积比添加1％-5％，igf-1的含量为50ng/ml-200ng/ml，胰岛素的含量为5μg/ml-10μg/ml，其余为dmem/f12基础培养基。其中，1％-5％的牛血提取物能够有效降低牛血提取物抑制分化的能力并使细胞在短期内保持正常的生长代谢；igf-1和胰岛素分别达到50ng/ml和5μg/ml时，能够诱导细胞分化，igf-1和胰岛素分别超过200ng/ml和10μg/ml时，细胞死亡。
13、本专利技术的有益效果在于：
14、(1)本专利技术采用多种手段实验后，得到了一种可以使鱼类永生化肌肉干细胞恢复干性的培养基，可以使永生化肌肉干细胞恢复干性，解决了随着体外培养时间的增加，肌肉干细胞的干性显著下降，只有通过不断分离纯化新的种子细胞才能持续进行细胞培养肉生产的问题。
15、(2)在鱼类永生化肌肉干细胞的干性得以恢复的基础上，本专利技术进一步得到了快速分化的方法，为之后细胞培养肉的规模化生产提供了一种可行的办法。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种干细胞干性恢复培养基，其特征在于包括以下成分：DMEM/F12基础培养基、牛血浆提取物、TubastatinA和褪黑素。
2.如权利要求1所述的干细胞干性恢复培养基，其特征在于：牛血浆提取物添加量为按体积比添加5％-10％，TubastatinA的含量为100μM-300μM，褪黑素的含量为100μM-500μM，其余为DMEM/F12基础培养基。
3.权利要求1或2所述的干细胞干性恢复培养基在诱导鱼类肌肉干细胞干性恢复中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述的干细胞干性恢复培养基诱导鱼类肌肉干细胞干性恢复及成肌分化的方法，其特征在于包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述分化培养基包括以下成分：DMEM/F12基础培养基、牛血浆提取物、IGF-1和胰岛素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：牛血浆提取物按体积比添加1％-5％，IGF-1的含量为50ng/ml-200ng/ml，胰岛素的含量为5μg/ml-10μg/ml，其余为DMEM/F12基础培养基。
【技术特征摘要】
1.一种干细胞干性恢复培养基，其特征在于包括以下成分：dmem/f12基础培养基、牛血浆提取物、tubastatina和褪黑素。
2.如权利要求1所述的干细胞干性恢复培养基，其特征在于：牛血浆提取物添加量为按体积比添加5％-10％，tubastatina的含量为100μm-300μm，褪黑素的含量为100μm-500μm，其余为dmem/f12基础培养基。
3.权利要求1或2所述的干细胞干性恢复培养基在诱导鱼类肌肉干细胞干性恢复中的应用。
4...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪伟，薛长湖，王明昊，魏迎新，袁婷婷，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。