表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。本发明专利技术的重组毕赤酵母，是将凝乳酶基因导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。所述凝乳酶基因的核苷酸序列是序列表中的序列１。本发明专利技术还公开了构建所述重组毕赤酵母的方法。本发明专利技术的重组毕赤酵母可用来生产牛凝乳酶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。
技术介绍
凝乳酶是从未断奶的小牛皱胃中提取的一种天冬氨酸蛋白酶，它可以切断k _酪蛋白导致乳的凝固。凝乳酶主要的生物学功能是水解牛乳中k -酪蛋白的Phe皿-Met皿键，导致牛乳凝结，因此被广泛用于干酪制造业，这个过程应用在干酪生产的第一阶段。传统的凝乳酶通过宰杀未断奶小牛从皱胃中提取。目前世界年均约5000万头小牛被宰杀供提取凝乳酶，由于全球性的小牛短缺使其来源变得不稳定，这种传统而昂贵的制法已不能满足世界干酪需求量不断增长的需要。利用微生物生物工程技术生产凝乳酶可以获得高纯度的凝乳酶，生产成本低，来源稳定。目前美国有70 % 、英国有90 %的干酪是用生物工程凝乳酶生产的。 我国自80年代就开展了凝乳酶的研究，1988年，谭思元等人研究了凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA的克隆，成功分离了 poly (A) RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA，并通过拼接pCT5及pCT15获得完整的凝乳酶原基因。中科院微生物所研究了凝乳酶原分子折叠和酶复性(唐兵，杨开宇1997 ;黎红晔等1998 ;陈红杰等2001)，并通过进一步对大肠杆菌中表达调控的研究，在大肠杆菌中表达了牛凝乳酶(王革等1994)。王志林等(2003)克隆了木瓜凝乳酶基因。 我国仅有一项关于牛凝乳酶基因工程的技术专利-大肠杆菌中表达外源基因的质粒和牛凝乳酶原的生产方法(ZL95105337X)。在凝乳酶的提取方面，有一项关于从犊牛皱胃中提取凝乳酶的技术专利，一项关于从木瓜中提取蛋白酶的技术专利(CN200410046107. 6)。 毕赤酵母表达系统具有表达量高、能进行蛋白质翻译后修饰、容易大规模生产、生产成本低、外源蛋白基因遗传稳定性较好等特点，目前国内外已有数百种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。Pichia. pastoris基因表达系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点(l)具有醇氧化酶A0X1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一 ；(2)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(3)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高； (4)毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。目前，在我国尚未见到利用毕赤氏酵母表达牛凝乳酶的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达凝乳酶的毕赤酵母及其构建方法与应用。 本专利技术所提供的表达凝乳酶的毕赤酵母，是将凝乳酶基因导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。 其中，所述凝乳酶基因来源于从小牛铍胃。 所述凝乳酶基因的核苷酸序列具体是序列表中的序列1。毕赤酵母表达系统具有 很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。它能够对外源蛋白进行翻译后加 工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。所述毕赤酵母 具体可为毕赤酵母GS115。 本专利技术的另一个目的是提供一种构建所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤 1)在酵母表达载体的多克隆位点插入凝乳酶基因构建重组酵母表达载体； 2)将所述重组酵母表达载体导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。 其中，所述酵母表达载体可为pPICZaA载体。所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。 本专利技术构建的表达凝乳酶的毕赤酵母中的一株命名为毕赤酵母DS115/pPICZaA/ Chy，毕赤酵母DS115/pPICZa A/Chy(Pichia pastoris)已于2008年11月12日保藏于中 国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCC NO.M 208217。 本专利技术所述的重组毕赤酵母可用来生产凝乳酶。 本专利技术首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了牛凝乳酶，分泌表达无需破碎细胞 且培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适合于工业规模的 高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于食品和医药等领 域。附图说明 图1为Xhol和Xbal酶切鉴定重组菌。 图2为酵液上清的SDS-PAGE电泳检测结果。具体实施例方式实施例1、表达牛凝乳酶的毕赤酵母 1)牛凝乳酶Chy的克隆 从刚出生的小牛皱胃中提取粘膜，加入液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液 氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管。室温放置 10min，使其充分裂解，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。 4°C 12，000g离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加 入异丙醇混匀，室温放置5-10min。 4°C 12， OOOg离心10min，弃上清，按lml 75X乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4°C 8， 000g离心5min，弃上清，室温晾 干5-10min，用70ul TE溶解总RNA，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。 设计引物Pl和P2，扩增牛凝乳酶基因，引物Pl和P2的核苷酸序列如下 Pl :5' ATGAGGTGTCTCGTGGTGCTAC 3'; P2 :5' GGGACAGTGAGGTTCTTGGT 3，。 PCR反应体系如下 10X PCR Buffer Minus Mg 5 ii 1、50mM MgCl2 1. 5ii l、10mM dNTP Mix 1 ii l、20uM P10. 5ii l、20uM P20. 5ii 1、Plati咖tag DNA polymerase (5U/ii 1) 0. 4 ii 1、cDNA 2iU、DEPC 水39. lii l，总体积50iU。 反应条件94。C变性30s，52。C退火30s、72。C延伸90s、32次循环，72。C延伸 lOmin。 用Fermentas公司的DNA Extraction Kit试剂盒(#K0513)回收PCR产物，PCR产物与pMD18-T载体16。C连接，构建重组载体pMD18-Chy，重组载体pMD18_Chy转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组菌，挑取重组菌单克隆，提取质粒，进行测序，测序结果表明扩增的牛凝乳酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。 2)表达牛凝乳酶(Chy)的毕赤酵母的构建 设计引物ZaAPreSl和ZaAPreS2，引物的核苷酸序列如下 ZaAPreS 1 :5' CGCTCGAGAAAAGAATGAGGTGTCTCGTGGT 3'(下划线为Xho I酶切位 点)(AAAAGA为pPICZ a系列载体a分泌因子的Kex2切割位点) ZaAPreAS2 :5' TGCTCTAGAATGATGGCTTTGGCCAGCC 3'(下划线为Xba I酶切位点) 以ZaAPreSl和ZaAPreS2为引物，重组载体pMD18_Chy作为模板，用TaKaRa公司 的Ex Taq酶进行PCR扩增。 反应条件94t:预变性5min ;然后进行94°C变性30s， 52°C退火30s、72°C延伸 90s， 32次循环；72。C延伸10min。 用F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组毕赤酵母，是将凝乳酶基因导入毕赤酵母中获得表达凝乳酶的重组菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨贞耐，张莉，王景会，姜媛媛，李玉秋，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]