【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫分析，具体涉及一种检测tpai.c的试剂盒制备方法以及提升其检测稳定性和准确性的方法。
技术介绍
1、组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活抑制物-1复合物(tissue plasminogenactivator-plasminogen activatorinhibitor-1complex，tpai.c)，是血管内皮细胞损伤时，释放t-pa与pai-1共同入血形成的复合物，因此可认为t-pa·pai-1复合物的上升反映血管受损程度。临床上认定tpai.c是综合反映纤溶系统和血管内皮细胞受损的分子标志物，提示病因未去除或血栓形成进行中。血液中tpai.c含量是静脉血栓栓塞(vte)的最佳诊断指标之一，也是心肌梗死的风险指标，还能判断术后血管内皮系统修复程度，监测血栓治疗药物效果。
2、目前，tpai.c主要通过酶促化学发光法来检测，该方法存在明显缺点，需要通过酶催化底物发光，发光速度较慢，其发光达到峰值需要经过一段时间的孵育反应，这不仅增加了检测的步骤，还延长了检测时间，其检测稳定性和准确性也差。由于血液样本中tpai.c的含量较少且不稳定，需在短时间内进行检测，如果检测时间长会导致血液样本中tpai.c检测结果不准确。而化学发光法的磁珠检测试剂盒结合磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术，具备高自动化、高灵敏度、高特异性等优点。其使用的吖啶酯标记物优势在于标记相对简单，无需催化剂或增强剂，发光机制是基于过氧化氢溶液和氢氧根的反应下，吖啶酯水解发光，其发光在0.5秒时就可以达到高峰，1秒以内可以发光完
3、市面上检测tpai.c的试剂盒没有统一的检测标准，导致试剂盒检测tpai.c的稳定性和准确性都不高。影响检测稳定性和准确性因素有吖啶酯和缓冲液。吖啶酯根据其吖啶环上取代物不同可分为吖啶酯和吖啶磺酰胺两大类，不同的取代基与标记抗体结合的稳定性不同，吖啶酯的种类影响试剂的稳定性，进而影响检测的准确性；缓冲液不仅保存试剂，还为检测tpai.c提供一个稳定环境，缓冲液起到保护稳定蛋白的作用，不同配方的缓冲液影响试剂的稳定性，进而影响检测的准确性。
4、因此，急需一种检测tpai.c的试剂盒及其应用，减少其检测时长，提高检测稳定性、准确性。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种化学发光法检测tpai.c的试剂盒制备方法及其优化方法。本专利技术试剂盒筛选出一种与tpai.c抗体结合最稳定的吖叮酯；本专利技术提供了一种缓冲液配方，能够提高试剂r1中标记抗体的吖叮酯的稳定性，进而提高试剂盒检测tpai.c的准确性；本专利技术提供了一种缓冲液配方，能够提高试剂rm中经抗体包被的磁性微球的稳定性，进而提高试剂盒检测tpai.c的准确性。本专利技术试剂盒使用的化学发光发属于闪光型而非酶促发光型，解决了发光法信号强度弱和检测时间长的技术问题。本专利技术试剂盒检测tpai.c具有操作过程简单、灵敏度高、准确性高、稳定性强、检测时间短、结果可靠、成本低等优点。
2、一方面，本专利技术提供一种检测tpai.c的试剂盒，其特征在于，包括试剂r1、试剂rm，所述r1包括吖啶酯标记的tpai.c单克隆抗体的发光结合物溶液，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
3、
4、所述rm包括tpai.c单克隆抗体包被的磁性微粒的固相悬浮物溶液。
5、进一步地，在所述的试剂盒，还包括试剂r1的缓冲液，所述缓冲液包括ph8.0±0.1、tris、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin 300。所述ph 8.0±0.1、tris、nacl提供一种工作环境，起缓冲的作用，tween、bsa起封闭作用，降低背景并增强特异性结合，海藻糖、甘氨酸起稳定、保护蛋白的作用，proclin起防腐作用。
6、进一步地，在所述试剂盒中，还包括试剂rm的缓冲液，所述缓冲液包括ph 6.0±0.1、mes、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin 300。所述ph 6.0±0.1、nacl提供一种工作环境，起缓冲的作用，mes起维持溶液的酸碱平衡作用，tween、bsa起封闭作用，降低背景并增强特异性结合，海藻糖、甘氨酸起稳定、保护蛋白的作用，proclin 300起防腐作用。
7、进一步地，在所述试剂盒中，还包括试剂r2，所述r2包括含阻断剂的试剂，所述试剂包括缓冲液，所述缓冲液包括ph 6.0±0.1、mes、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin 300。所述阻断剂的作用为阻断非特异性反应，提高检测的特异性和准确性。
8、进一步地，在所述试剂盒中，所述试剂r1中吖啶酯标记的tpai.c单克隆抗体浓度为0.08mg/l，所述试剂rm中tpai.c单克隆抗体包被的磁性微球浓度为0.4mg/ml，所述试剂r2中阻断剂的浓度为0.2mg/ml。
9、进一步地，本专利技术提供一种化学发光法检测tpai.c的试剂盒制备方法，所述试剂盒试剂rm、试剂r1、试剂r2采用前处理后再进行配置，包括以下步骤：
10、(1)试剂rm的配置：tpai.c单克隆抗体包被磁性微球，使用试剂rm缓冲液将tpai.c单克隆抗体包被的磁性微球稀释为0.4mg/ml；
11、(2)试剂r1的配置：吖啶酯标记tpai.c单克隆抗体，使用试剂r1缓冲液将吖啶酯标记的tpai.c单克隆抗体稀释至0.08mg/l；
12、(3)试剂r2的配置：使用试剂r2缓冲液将阻断剂稀释至0.2mg/ml。
13、另一方面，本专利技术提供一种吖啶酯用于提高检测tpai.c的稳定性和准确性，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
14、
15、吖啶类化合物根据其吖啶环上取代物不同分为两大类吖啶酯和吖啶磺酰胺，它们与不同抗体结合后稳定性不同，具体细分为6种，但能用作化学发光标记的只有4种。其为吖啶酯为dmae-nhs，其结构式：
16、
17、nsp-dmae-nhs，结构式：
18、
19、吖啶磺酰胺为nsp-sa-nhs，结构式：
20、
21、nsp-sa-adh，结构式：
22、
23、这4种吖啶酯/吖啶磺酰胺都常作为化学发光标记物，但与抗凝血酶抗体的结合能力不同。吖啶酯nsp-dmae-nhs、dmae-nhs具有酰基和磺酸基团，可使抗体偶联的发光强度更高，并且在缓冲液中较稳定；吖啶磺酰胺nsp-sa-nhs具有磺酰胺基和羧基结构空间位阻大，水解稳定性好，热稳定性和信噪比高；nsp-sa-adh具有酰肼基团，其末端的活性基团与含有醛基的抗体发生反应。本专利技术通过研究证明，吖啶酯nsp-sa-nhs与tpai.c单抗结合更稳定，可能与其本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测tPAI.C的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂RM，所述R1包括吖啶酯标记的tPAI.C单克隆抗体的发光结合物溶液，所述吖啶酯为NSP-SA-NHS，结构式：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂R1的缓冲液，所述缓冲液包括pH 8.0±0.1、tris、NaCl、Tween、BSA、海藻糖、甘氨酸、proclin300。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂RM的缓冲液，所述缓冲液包括pH 6.0±0.1、MES、NaCl、Tween、BSA、海藻糖、甘氨酸、proclin300。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂R2，所述R2包括阻断剂的溶液，所述R2还包括缓冲液，所述缓冲液包括pH 6.0±0.1、MES、NaCl、Tween、BSA、海藻糖、甘氨酸、proclin 300。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中吖啶酯标记的tPAI.C单克隆抗体浓度为0.08mg/L，所述试剂RM中tPAI.C单克隆抗体包被的磁性微球浓度为0.4
6.一种磁性微球化学发光检测tPAI.C的方法，其特征在于，采用如权利要求1～5任一项所述的试剂盒进行检测。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒试剂RM、试剂R1、试剂R2采用前处理后再进行配置，包括以下步骤：
8.一种吖啶酯用于提高检测tPAI.C的稳定性和准确性，其特征在于，所述吖啶酯为NSP-SA-NHS，结构式：
9.一种缓冲液用于提高试剂R1稳定性及检测准确性，其特征在于，所述缓冲液包括pH8.0±0.1、3.03g/L tris、8.18g/L NaCl、5ml/L Tween、10g/L BSA、20g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、1ml/L proclin 300。
10.一种缓冲液用于提高试剂RM稳定性及检测准确性，其特征在于，所述缓冲液包括pH6.0±0.1、19.524g/L MES、8.18g/L NaCl、5ml/L Tween、10g/LBSA、20g/L海藻糖、10g/L甘氨酸、1ml/L proclin 300。
...【技术特征摘要】
1.一种检测tpai.c的试剂盒，其特征在于，包括试剂r1、试剂rm，所述r1包括吖啶酯标记的tpai.c单克隆抗体的发光结合物溶液，所述吖啶酯为nsp-sa-nhs，结构式：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂r1的缓冲液，所述缓冲液包括ph 8.0±0.1、tris、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin300。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂rm的缓冲液，所述缓冲液包括ph 6.0±0.1、mes、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin300。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括试剂r2，所述r2包括阻断剂的溶液，所述r2还包括缓冲液，所述缓冲液包括ph 6.0±0.1、mes、nacl、tween、bsa、海藻糖、甘氨酸、proclin 300。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂r1中吖啶酯标记的tpai.c单克隆抗体浓度为0.08mg/l，所述试剂rm中tpai.c单克隆抗体包被的磁性微球浓度为0.4m...
【专利技术属性】
技术研发人员：张艳华，王涛，余海鹏，刘晓东，龚庆，洪龙斌，
申请(专利权)人：中翰盛泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。