【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分子学，具体涉及一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对及其应用。
技术介绍
1、芽孢杆菌可耐高温及干燥，对外界抵抗力很强，有些芽孢杆菌的芽孢体可在土壤中存活数十年，有的煮沸3~4小时仍可存活，在105℃尚可存活1.5小时左右，有的种（株）食用一定数量可以引起肠炎，属于条件致病菌。有研究发现在制药企业的产品、环境、物料中均检出多种芽孢杆菌且物料中芽孢杆菌占比较大（54%）。中成药因含有大量的有机质，在生长、储藏、加工过程中易受各种微生物的污染，尤其极易受到芽孢杆菌属的污染，直接影响制剂成品的质量。需要结合更多生产过程控制来保证产品质量，将污染菌株的分离、鉴定与分析作为中成药口服给药制剂及其原料药质量标准的重要组成部分，进一步开展生产过程与微生物限度检查结果相关性的研究，以减少中成药生产各工序环节中诱发药品微生物污染因素。
2、短小芽孢杆菌（bacillus pumilus）、高地芽孢杆菌（bacillus altitudinis）和沙福芽孢杆菌（bacillus safensis）均属于中成药中检出频率较高的三种近缘芽孢杆菌，通过生物质谱、vitek全自动微生物分析系统和16srdna测序法均难以较好地将它们与其他的芽孢杆菌进行区分，因此需要一种准确有效的分子生物学方法来快速鉴别这三种近缘芽孢杆菌。
技术实现思路
1、为了解决现有的生物质谱、vitek全自动微生物分析系统和16srdna测序难以较好地将短小芽孢杆菌、高地芽孢杆
2、根据本专利技术的第一个方面，提供一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对，该引物对包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，第一下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
3、本专利技术基于gyra基因设计得到核苷酸序列如seq id no：1所示的第一上游引物、核苷酸序列如seq id no：2所示的第一下游引物并将其应用于芽孢杆菌的检测中，利用pcr扩增技术能够特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌，可以将这三种近缘芽孢杆菌与其他的芽孢杆菌很好地进行区分，同时对pcr扩增产物进行双向测通并利用blastn同源比对到ncbi核酸数据库，可以得到准确的菌种信息，短小/高地/沙福芽孢杆菌的序列相似度小于97%。综上，利用本专利技术提供的引物对可以将短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌这三种近缘菌种与其他种类的芽孢杆菌进行区分，达到鉴别短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌这三种近缘菌种的目的，通过双向测通可以将短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌这三种近缘菌种进行区分。
4、根据本专利技术的第二个方面，提供上述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对在短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌的检测中的应用。
5、根据本专利技术的第三个方面，提供一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的试剂盒，该试剂盒包括上述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对。
6、根据本专利技术的第四个方面，提供一种特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
7、s1.从待测菌株中提取基因组dna；
8、s2.利用引物对提取得到的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物，其中，所采用的引物包括上述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对；
9、s3.对扩增产物进行鉴定。
10、优选地，在s2中，引物还包括用于检测枯草芽孢杆菌的引物对、用于检测解淀粉芽孢杆菌的引物对、用于检测地衣芽孢杆菌的引物对和用于检测巨大芽孢杆菌的引物对；
11、上述用于检测枯草芽孢杆菌的引物对包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物的核苷酸序列如seq id no：3所示，第二下游引物的核苷酸序列如seq id no：4所示；
12、上述用于检测解淀粉芽孢杆菌的引物对包括第三上游引物和第三下游引物，第三上游引物的核苷酸序列如seq id no：5所示，第三下游引物的核苷酸序列如seq id no：6所示；
13、上述用于检测地衣芽孢杆菌的引物对包括第四上游引物和第四下游引物，第四上游引物的核苷酸序列如seq id no：7所示，第四下游引物的核苷酸序列如seq id no：8所示；
14、上述用于检测巨大芽孢杆菌的引物对包括第五上游引物和第五下游引物，第五上游引物的核苷酸序列如seq id no：9所示，第五下游引物的核苷酸序列如seq id no：10所示。
15、优选地，在s2中，pcr扩增的反应体系包括如下组分：引物，基因组dna，dntps，taqdna聚合酶。
16、优选地，引物的用量为（10~100）×10-6μmol。
17、优选地，基因组dna的用量为10~100 ng。
18、优选地，在s2中，pcr扩增的条件如下：94℃下预变性3 min；94℃下变性30 s，60℃下退火30s，72℃下延伸30 s，30个循环；72℃下保温10 min。
19、优选地，s3的具体操作如下：采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离得到电泳条带，同时对扩增产物进行双向测通。
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1.一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对，其特征在于：所述引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对在短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌的检测中的应用。
3.一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对。
4.一种特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于：在所述S2中，所述引物还包括用于检测枯草芽孢杆菌的引物对、用于检测解淀粉芽孢杆菌的引物对、用于检测地衣芽孢杆菌的引物对和用于检测巨大芽孢杆菌的引物对；
6.如权利要求4所述特异性检测短
7.如权利要求6所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述引物的用量为（10~100）×10-6 μmol。
8.如权利要求6所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述基因组DNA的用量为10~100 ng。
9.如权利要求4所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于，在所述S2中，所述PCR扩增的条件如下：94℃下预变性3 min；94℃下变性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，30个循环；72℃下保温10 min。
10.如权利要求4所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述S3的具体操作如下：采用琼脂糖凝胶电泳对所述扩增产物进行分离得到电泳条带，同时对所述扩增产物进行双向测通。
...【技术特征摘要】
1.一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对，其特征在于：所述引物对包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq id no：2所示。
2.如权利要求1所述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对在短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌的检测中的应用。
3.一种用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述用于特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的引物对。
4.一种特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.如权利要求4所述特异性检测短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的方法，其特征在于：在所述s2中，所述引物还包括用于检测枯草芽孢杆菌的引物对、用于检测解淀粉芽孢杆菌的引物对、用于检测地衣芽孢杆菌的引物对和用于检测巨大芽孢杆菌的引物对；
6.如权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：严卓彦，
申请(专利权)人：舟山市食品药品检验检测研究院，
类型：发明
国别省市：
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