【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，尤其涉及一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、腹泻病是由多种病原体和因素引起的一组以大便性状改变为特征的疾病。急性感染性腹泻病定义为由体内或病原微生物感染引起的病程不足2周的腹泻病。急性感染性腹泻病发病率高，流行范围广，严重危害儿童健康。由于其发病率高，对儿童健康危害大，是儿童营养不良、生长发育障碍和死亡的重要原因之一。该病的临床表现主要有消化道症状、全身症状及水、电解质及酸碱平衡紊乱。具体表现为大便性状改变，如稀糊便、水样便、黏液便、脓血便；大便次数增多，每日3次以上，甚至10～20次/日；伴有恶心、呕吐、腹痛、腹胀、食欲不振、发热、烦躁、精神萎靡、嗜睡，也可伴有心、脑、肝、肾等其他器官系统受累表现。严重时不同程度的脱水、代谢性酸中毒、低钾血症、低钠或高钠血症，也可有低钙血症、低镁血症。
2、儿童急性感染性腹泻病诊疗规范(2020年版)明确指出该病的病原体包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。细菌中常见产毒性大肠埃希菌(etec)、致病性大肠埃希菌(epec)、侵袭性大肠埃希菌(eiec)、出血性大肠埃希菌(ehec)、黏附性大肠埃希菌(eaec)、空肠弯曲菌(cje)、鼠伤寒沙门菌(styp)、肠炎沙门菌(se)、o1群霍乱弧菌(vc o1)、o139群霍乱弧菌(vco139)、志贺菌(sd)、小肠结肠炎耶尔森菌(yent)、艰难梭菌(cdiff)、金黄色葡萄球菌(sa)和副溶血性弧菌(vp)；真菌中常见念珠菌(ca)、毛霉菌(muc)和
3、由于引起腹泻的病原体多，且临床体征难以区分，因此，病原的准确鉴别分析对于医生或患者尽早及时的制定合理的医疗方案具有重要意义。在感染性疾病领域，准确诊断是精准防控的前提。在缺乏病原信息的情况下及时准确地确定腹泻病感染病原的类型，便于抗生素的规范使用。
4、现有的腹泻病原体检测方法中，经典的病原体检测技术为病原体的分离培养，但操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，且实验安全性和结果准确性相对难以保证。免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，但耗时较长、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。目前，许多分子生物学技术应用到腹泻病原体的检测中，如聚合酶链式反应(pcr)、高通量测序等，然而这些技术有其自身的应用缺点，且依赖大型仪器设备，费用昂贵，不适合大规模筛查。普通qpcr(荧光-探针法)平台检测虽然可进行多种病原体同时检测，但每台仪器最多只能检测4-6种病原，致使在检测多基因时，需要分别配制对应的试剂，且每一种试剂都需要单独加一次模板，这样就会使检测样本模板量增加，其对应的检测试剂成本增加且操作繁琐，无法满足临床检测需求，尤其是儿童急性感染性腹泻病相关病原体种类较多，要做到尽可能多的病原体类型的检测，不仅检测成本高，而且要多次操作，较为繁琐。
5、因此，目前迫切需要一种能够实现多种儿童急性感染性腹泻病相关病原的快速同时检测的方法，这对感染性腹泻的临床诊断与用药具有重要的指导意义。
6、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对现有技术中的荧光定量qpcr检测平台难以在同一管同步检测多种腹泻相关病原体的技术问题，本专利技术提供了一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物、试剂盒及检测方法，该引物探针组合物及其试剂盒可实现15种腹泻致病细菌的同步检测，在此基础上还可进一步实现同步检测3种致病真菌和4种寄生虫的检测，检测效率高，特异性强，灵敏度高，可应用在急性感染性腹泻病的临床检测中。
2、为解决上述问题，本申请提供以下技术方案：
3、第一方面，本申请提供一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的探针，所述引物探针组合物包括至少10组以下分别用于检测各种腹泻致病细菌的引物探针：
4、用于检测产毒性大肠埃希菌(etec)elta基因的引物探针：如seq id no.1所示的正向引物etec-f，如seq id no.2所示的反向引物etec-r，如seq id no.3所示的荧光探针etec-p；
5、用于检测致病性大肠埃希菌(epec)eaea基因基因的引物探针：如seq id no.4所示的正向引物epec-f，如seq id no.5所示的反向引物epec-r，如seq id no.6所示的荧光探针epec-p；
6、用于检测侵袭性大肠埃希菌(eiec)的ipah基因的引物探针：如seq id no.7所示的正向引物eiec-f，如seq id no.8所示的反向引物eiec-r，如seq id no.9所示的荧光探针eiec-p；
7、用于检测出血性大肠埃希菌(ehec)的rfbe基因的引物探针：如seq id no.10所示的正向引物ehec-f，如seq id no.11所示的反向引物ehec-r，如seq id no.12所示的荧光探针ehec-p；
8、用于检测黏附性大肠埃希菌(eaec)的afa基因的引物探针：如seq id no.13所示的正向引物eaec-f，如seq id no.14所示的反向引物eaec-r，如seq id no.15所示的荧光探针eaec-p；
9、用于检测空肠弯曲菌(cje)的hipo基因的引物探针：如seq id no.16所示的正向引物cje-f，如seq id no.17所示的反向引物cje-r，如seq id no.18所示的荧光探针cje-p；
10、用于检测鼠伤寒沙门菌(styp)的fljb基因的引物探针：如seq id no.19所示的正向引物styp-f，如seq id no.20所示的反向引物styp-r，如seq id no.21所示的荧光探针styp-p；
11、用于检测肠炎沙门菌(se)的tcps基因的引物探针：如seq id no.22所示的正向引物se-f，如seq id no.23所示的反向引物se-r，如seq id no.24所示的荧光探针se-p；
12、用于检测o1群霍乱弧菌(vc o1)的rfbv基因的引物探针：如seq id no.25所示的正向引物vco1-f，如seq id no.26所示的反向引物vco1-r，如seq id no.27所示的荧光探针vco1-p；
13、用于检测o139群霍乱弧菌(vc o139)的vcm8基因的引物探针：如seq id no.28所示的正向引物vco139-f，如seq id no.29所示的反向引物vco139-r，如seq id no.30所示的荧光探针vco139-p；
14、用于检测志贺菌(sd)的ipah-teh1基因引物探针：如seq 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物，其特征在于，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的探针，所述引物探针组合物包括至少10组以下分别用于检测各种腹泻致病细菌的引物探针：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病真菌的引物探针：
3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病寄生虫的引物探针：
4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于检测内参RNaseP基因的引物探针：如SEQ ID NO.67所示的正向引物RP-F，如SEQ ID NO.68所示的反向引物RP-R，如SEQ ID NO.69所示的荧光探针RP-P。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5和VIC中的任一种，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，荧光探针ETEC-P、EAEC-P、VCO1-P、Cdiff-P、M
7.一种用于同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～6中任一项所述的引物探针组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括冻干反应试剂，所述冻干反应试剂包括：如权利要求1所述的引物探针组合物、DNA聚合酶、反应Buffer、dNTP、dUTP以及冻干保护剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品包含各个靶标基因杂合突变基因型序列和RP基因序列。
10.一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关病原体的方法，为非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，该方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种同步检测多种急性感染性腹泻病相关的病原体的引物探针组合物，其特征在于，包括扩增引物对及与所述扩增引物对应的探针，所述引物探针组合物包括至少10组以下分别用于检测各种腹泻致病细菌的引物探针：
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病真菌的引物探针：
3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括以下用于检测多种腹泻致病寄生虫的引物探针：
4.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于检测内参rnasep基因的引物探针：如seq id no.67所示的正向引物rp-f，如seq id no.68所示的反向引物rp-r，如seq id no.69所示的荧光探针rp-p。
5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自fam、rox、cy5和vic中的任一种，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2或bhq3。
6.根据权利要求5所述的引物探针组合物，其特征在于，荧光探针etec-p、eaec-p、vco1-p、cdiff-p、muc-p和enhs-p5’端标记有fam荧光报告基团，3’端标记有...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，王含，田永帅，刘嘉男，左雪梅，刘万建，宋金玲，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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