【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种结核分枝杆菌全基因组捕获方法、引物组及试剂盒。
技术介绍
1、结核分枝杆菌(mycobacterium tubercμlosis,mtb)是结核病(tubercμlosis)的病原体。结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，它严重危害人类的健康和社会发展。当前结核病防治工作面临巨大挑战。对结核分枝杆菌感染的准确诊断在结核病防治起着关键作用。如果直接针对原始临床样本进行通常全基因组测序(whole genomesequencing,wgs)，在24h～48h即可提供精确序列，对判断细菌基因突变位点准确、及时，还可发现新的突变位点，以及应用于流行病学、mtb耐药机制研究。尽管mtb的耐药机制尚不完全明确，也没有一个完整的数据库用于基因组测序后的药敏检测和表型预测，但全基因组测序工作可整合到常规诊断工作流程，以逐步取代早期诊断检测中药敏表型检测技术。
2、全基因组测序(wholegenomesequencing,wgs)作为一种常用的基因分型技术具有高分辨率特点，不仅能够识别基因组上的单核苷酸多态性(snp)确定mtb在传播过程中的微进化，还可以获得目的基因组上的全部序列，预测大多数抗结核药物的耐药性。ngs在mtb耐药性检测中应用：ngs由于其具有简便、快速、准确和可靠等优点，被临床广泛应用在mtb耐药性检测中，特别是对检测多重耐药的结核病人，是有效治疗耐药结核分枝杆菌的关键。
3、通过全基因组测序技术获得mtb全基因序列，利用已知的mtb耐药机制，在全基因水平
4、因此获得mtb全基因组的意义非常重大。
技术实现思路
1、为弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌全基因组捕获方法、引物组及试剂盒。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供一种用于结核分枝杆菌全基因组扩增的引物组合。
4、进一步，所述引物组合包括针对结核分枝杆菌细胞基因组设计的20条引物，所述20条引物具有ttcgtcga、cgataccg、cgatcgtc、cttcgtcg、cgaagtcg、cgaatccg、cgaactcg、cgattccg、cgatcagc、gttgaccg、gttgtcgg、gtcgtcg、atcgtcg、tcgtcgg、cgaaccg、gcgaacg、cgtaccg、cgtagcg、cgtcgta、tatcgcg所示的序列。
5、在本专利技术中，引物组合与引物可以互换使用，引物是指短的核酸分子，本专利技术公开的引物长度在7到8个核苷酸之间。可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的。
6、靶核酸分子是指打算对其进行检测、定量、定性检测或其组合的核酸分子。核酸分子不是必须处于纯化的形式。各种不同的其它核酸分子也可以与靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在对其进行扩增的特异性核酸分子。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如使用可商购的纯化试剂盒等。
7、在一些实施方案中，与本专利技术所述的引物和/或探针序列具有70％以上同源性的序列对应的引物和/或探针也均包含在本专利技术的保护范围内，也即可以理解为：在本专利技术提供的引物和/或探针的基础上进行改变之后得到的引物和/或探针同样落入本专利技术的保护范围。
8、本专利技术第二方面提供一种试剂盒。
9、进一步，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物组合。
10、进一步，所述试剂盒还包括pcr扩增缓冲液、扩增酶、dtt、dntp、焦磷酸酶、无核酸酶纯水。
11、进一步，所述扩增酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。
12、优选地，所述扩增酶为dna聚合酶。
13、进一步，所述试剂盒还包括说明书。
14、在本专利技术中，适合量的一种或多种引物被提供在一个或多个容器中，或固定在基质上，引物可以被提供成悬浮在水溶液中，或例如作为冷冻干燥的或冻干的粉末。其中，提供有核酸的容器可以是任何能够容纳所提供的形式的常规容器，例如微量离心管、安瓿瓶或瓶。试剂盒可以包含标记的或未标记的、用于检测结核分枝杆菌序列的探针。
15、在某些应用中，一个或多个引物(如上所述)，可以预先测量好的单次使用量提供在独立的、典型情况下用后即可抛弃的管或相当的容器中。使用这样的设置，用于测试消化道病毒的存在的样品，可以加入到独立的管中，直接进行扩增。
16、试剂盒中提供的核酸引物的量，可以是任何适合的量，可以依赖于产品所针对的靶市场。例如，如果试剂盒适用于研究或临床应用，提供的每种核酸引物的量，可以是足够引发几个pcr扩增反应的量。确定适合的量的一般性指导，可以在innis等、sambrook等和ausubel等的文献中发现。试剂盒可以包含两个以上的引物，以便于较大量结核分枝杆菌核苷酸序列的pcr扩增。
17、在某些实施方案中，试剂盒可以含有执行pcr扩增反应所必需的反应试剂，包括dna样品制备试剂、用于pcr的酶、缓冲液、mg2+和脱氧核糖核苷酸(dntps)。
18、其中，pcr的酶包括dna聚合酶和/或rna聚合酶。
19、所述dna聚合酶包括但不限于taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4 dna聚合酶、klenow片段。
20、dntp是为了进行基于pcr的dna扩增的核苷源，datp、dgtp、dctp、dttp这4种是必要的。另外，关于dntp，可使用为了用于热启动法而进行了化学修饰的物质，例如可使用trilink biotechnologies，inc.制cleanamptmdntp。
21、在基于pcr的dna扩增中，mg2+是必要的。作为mg2+源，包括但不限于mgcl2、mgso4等。
22、在本专利技术中，所述试剂盒还包括说明书，说明书可以包括关于获得样品、处理样品的指导。
23、此外，试剂盒中可包含作为pcr的阳性对照而使用的细菌的基因组dna、作为阴性对照而使用的无菌水。
24、实施本专利技术时，作为另外的必要的器具，可举出移液器、移液器用枪头、1.5ml微型管(microtube)等在分子生物学的实验中广泛使用的器具类，作为装置类，可举出pcr、净化台、管用离心机等在分子生物学的实验中广泛使用的仪器。
25、本专利技术第三方面提供一种获得结核分枝杆菌全基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于结核分枝杆菌全基因组扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括针对结核分枝杆菌细胞基因组设计的20条引物，所述20条引物具有TTCGTCGA、CGATACCG、CGATCGTC、CTTCGTCG、CGAAGTCG、CGAATCCG、CGAACTCG、CGATTCCG、CGATCAGC、GTTGACCG、GTTGTCGG、GTCGTCG、ATCGTCG、TCGTCGG、CGAACCG、GCGAACG、CGTACCG、CGTAGCG、CGTCGTA、TATCGCG所示的序列。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、扩增酶、DTT、dNTP、焦磷酸酶、无核酸酶纯水；
4.一种获得结核分枝杆菌全基因组序列的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的引物组合进行结核分枝杆菌的全基因组序列的扩增。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1所述的引物组合针对样品进行PCR扩增、回收并纯化扩增
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以总体积18μL计，所述PCR扩增的体系包括：Reaction Mix 2μL、Primer Mix 5μL、dNTP Mix 2μL、DTT 2μL、DNA样品1ng～1μg，余量为水；
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本包括痰、咽喉拭子、体液、分泌物、穿刺液、粪便等。
8.一种检测结核分枝杆菌的文库，其特征在于，所述文库包括权利要求1所述的引物组合。
9.权利要求1所述的引物组合在制备扩增或检测结核分枝杆菌核酸序列的产品中的应用。
10.权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在扩增结核分枝杆菌全基因组序列或在结核分枝杆菌测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于结核分枝杆菌全基因组扩增的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括针对结核分枝杆菌细胞基因组设计的20条引物，所述20条引物具有ttcgtcga、cgataccg、cgatcgtc、cttcgtcg、cgaagtcg、cgaatccg、cgaactcg、cgattccg、cgatcagc、gttgaccg、gttgtcgg、gtcgtcg、atcgtcg、tcgtcgg、cgaaccg、gcgaacg、cgtaccg、cgtagcg、cgtcgta、tatcgcg所示的序列。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr扩增缓冲液、扩增酶、dtt、dntp、焦磷酸酶、无核酸酶纯水；
4.一种获得结核分枝杆菌全基因组序列的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1所述的引物组合进行结核分枝杆菌的全基因组序列的扩增...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小敏，赵雁林，吴霞，欧喜超，卢雨晴，赵冰，史凯旋，邢睿达，刘二勇，
申请(专利权)人：北京微未来科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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