【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药鉴别，尤其涉及一种鉴别栀子的引物对、试剂盒及应用。
技术介绍
1、中药材的生物学来源十分复杂，由于主观掺伪或意外混入，常出现中药产品基原混杂的情况，进而影响药品质量。栀子是茜草科植物栀子gardenia jasminoides ellis的干燥成熟果实。性味苦、寒，入心、肝、肺、三焦经，具有清热利尿、泻火除烦、凉血解毒之功效，现代药理研究发现栀子具有保肝、抗炎、镇痛及改善心脑血管病等方面的作用。水栀子为茜草科植物栀子gardenia jasminoides ellis的多个变种药材商品名的统称，且不同省份种植的水栀子基原各异。目前，水栀子并未列入历版《中国药典》和部颁标准，被视为栀子的伪品药材。在药材层面，一般可基于外观形态鉴别栀子、水栀子药材。栀子多为倒卵形或椭圆形，水栀子多为长椭圆形，果柄较长；栀子果体较小，水栀子果体较大。但经加工处理后，则无法通过形态、显微特征区分二者。同时二者间缺乏特征性化合物以供鉴别使用，主要药效成分栀子苷含量亦无明显差异。因此，迫切需要建立一种客观、科学的鉴别方法，用于含栀子中药制品的监管。
技术实现思路
1、针对以上技术问题，本专利技术提供了一种鉴别栀子的引物对、试剂盒及应用。本申请提供的引物对和试剂盒能够快速、准确鉴别栀子及其伪品水栀子，可用于栀子原料及含栀子的产品的质量检测。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种鉴别栀子的引物对，包括序列如seq
4、seq id no.1的序列为：5′-ctaagatcttctcggcccgc-3′；
5、seq id no.2的序列为：5′-accgtgggttataccaagca-3′。
6、以上引物对是基于人工拼接的栀子与水栀子的叶绿体基因组环经人工设计得到。经鉴定能力评估，以上述引物对作为特异性引物进行pcr扩增后，变异位点能够稳定存在，从而能够根据变异位点进行栀子与水栀子的鉴定。
7、利用上述引物结合pcr-rflp技术，可快速、准确地对栀子进行鉴定，具有实用性和经济性等优点，为栀子的质量检测和市场监管提供了可靠的技术支持。
8、第二方面，本专利技术还提供一种鉴别栀子的试剂盒，包括由seq id no.1所示的上游引物和seq id no.2所示的下游引物组成的引物对。
9、优选地，所述试剂盒还包括限制性核酸内切酶taqi。
10、由上述引物对扩增得到的扩增产物在106bp处有变异位点：栀子为c，水栀子为t。针对该变异位点，选择使用限制性核酸内切酶taqi(5′…t^cga…3′)进行酶切，能够将栀子酶切成106bp(序列如seq id no.3所示)和80bp(序列如seq id no.4所示)的两端序列，而水栀子无法酶切。
11、seq id no.3的序列为：
12、ctaagatcttctcggcccgcagggggttctttttctttttgattctgatttt
13、gattctttatttgtttatttgatggtataacacattccgccttttgctttcca t；
14、seq id no.4的序列为：
15、cgacgtttttattgttactaataacgctttcatttagattcaaattgaaaagaagtgctttgcttggtataacccacggt。
16、优选地，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、dna聚合酶、模板dna和酶切缓冲液，所述pcr缓冲液中含有镁离子和脱氧核苷三磷酸(dntp)。pcr缓冲液、dna聚合酶和酶切缓冲液均可选择用于pcr扩增和酶切的市售试剂，例如，可选用宝日医生物技术有限公司的gflextmbuffer、tks gflextm dna polymerase和翌圣生物科技(上海)股份有限公司的10×funicuttm buffer。模板dna为待测样品的总dna。
17、第三方面，本专利技术还提供了上述引物的应用，包括：
18、鉴别栀子与水栀子原料的应用；
19、鉴别中成药中栀子与水栀子的应用。
20、结合第三方面，所述应用为使用上述引物进行pcr扩增，对扩增引物进行酶切。
21、优选地，该应用的具体步骤包括：
22、s1、提取待测样品的总dna；
23、s2、以所述总dna为模板dna，用上述引物进行pcr扩增；
24、s3、对扩增产物使用限制性核酸内切酶taqi进行酶切，通过酶切结果进行判断：pcr扩增产物能够被酶切的待测样品为栀子，否则为水栀子。
25、采用本申请提供的引物组合物可以特异性扩增栀子和水栀子的特征序列，结合pcr-rflp可以特异性识别栀子序列并进行切割，而水栀子序列不会被切割，从而实现栀子与水栀子进行鉴别。
26、优选地，所述pcr扩增的反应体系为：
27、
28、扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，62℃，15s，68℃，30s，35个循环；68℃，5min。
29、在该pcr扩增的反应体系中，模板dna的浓度可根据pcr扩增的效果进行常规调整。
30、优选地，所述酶切的反应体系为：
31、
32、酶切反应条件为：65℃水浴孵育15～30min。
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1.一种鉴别栀子的引物对，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
2.一种鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO.2所示的下游引物组成的引物对。
3.根据权利要求2所述的鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性核酸内切酶TaqI。
4.根据权利要求3所述的鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、模板DNA和酶切缓冲液，所述PCR缓冲液中含有镁离子和脱氧核苷三磷酸。
5.权利要求1所述引物对的应用，包括：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，对扩增引物进行酶切。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体步骤包括：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酶切的反应体系为：
【技术特征摘要】
1.一种鉴别栀子的引物对，其特征在于，包括序列如seq id no.1所示的上游引物和序列如seq id no.2所示的下游引物。
2.一种鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，包括由seq id no.1所示的上游引物和seq idno.2所示的下游引物组成的引物对。
3.根据权利要求2所述的鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性核酸内切酶taqi。
4.根据权利要求3所述的鉴别栀子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晓轩，张悦，杨文志，王跃飞，郭华，郑新元，周军，吴红华，张鹏，李雪，牛辰瑾，赵晨，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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