【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种人副流感病毒重组抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
1、人副流感病毒（ human parainfluenza virus，hpiv）属于副粘病毒科，是一种具有包膜的单股负链rna病毒，是一类常见的社区获得性呼吸道感染病原体，通过人与人的直接接触和飞沫经呼吸道传播进行感染。其感染率仅次于呼吸道合胞病毒（rsv）。人副流感病毒（hpiv）分为4个血清型（hpiv-1、2、3、4a、4b），其中hpiv-3感染率高，持续时间长。hpiv主要侵犯成人的呼吸道粘膜表层组织，在上皮细胞内增殖，引起病变较轻的上呼吸道感染（uri）。5岁以下婴幼儿，hpiv主要侵犯气管、支气管粘膜上皮细胞，引起细胞病变、坏死和粘膜糜烂，导致婴幼儿严重的下呼吸道感染。该病毒侵犯肺泡上皮间质细胞，会引起间质性肺炎或表现为急性阻塞性喉气管支气管和肺炎。感染者在无症状情况下能持续释放病毒传染。hpiv感染的临床症状表现与其他呼吸道病毒感染无特异性差别，因此在感染初期快速、准确的诊断尤为重要。
2、现阶段人副流感病毒感染的诊断方法主要分为两大类，一类是通过组织培养等方式直接检测样品中的抗原，在培养的细胞中分离检测病毒，利用免疫荧光法（ifa）、酶联免疫法（eia）、聚合酶链式反应（pcr）等方法来检测病毒，但这类方法都需要培养和分离病毒，需要特定实验环境或者仪器来完成，而且检测时间较长，成本较高，不适宜临床快速检测，难以大范围推广。另一类诊断方法为检测特定时期病人血清中的
3、目前检测试剂盒中应用的人副流感病毒抗原产品少，并且目前主要采用天然培养的病毒，虽然特异性好，但是制备成本较高，且操作有一定风险性。因此研发特异型好、灵敏度高的人副流感病毒重组抗原迫在眉睫。
4、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种人副流感病毒重组抗原及其制备方法和应用，该人副流感病毒重组抗原通过基因的选择和特异性识别位点的优化等来提高融合蛋白抗原的特异性，该重组抗原可在大肠杆菌表达系统中进行表达，可进行批量化的工业化生产，极大地提高人副流感病毒重组抗原的生产效率和产量，减小批间差。
2、第一方面，本申请提供一种人副流感病毒重组抗原，其由hn蛋白片段和f蛋白片段组成，该抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、在人副流感病毒重组抗原的开发过程中，专利技术人发现，人副流感病毒（hpiv）包膜表面突出的两种糖蛋白（融合蛋白f、血凝素神经氨酶蛋白hn）制备的融合抗原的特异性高。其中，融合蛋白（fusion protein，f），具有促进细胞融合作用和溶血特性，ｆ蛋白属ⅰ型糖蛋白，只有裂解成f1和f2后才具有细胞膜融合活性；而血凝素—神经氨酶蛋（ hemagglutinin-neuraminidase，hn），具有红细胞凝集活性和神经氨酶活性。hn蛋白属ⅱ型糖蛋白，在病毒的入侵和感染过程中主要发挥识别靶细胞表面唾ａ酸受体，促进细胞融合和发挥神经氨酸酶的活性裂解唾液酸受体等功能。人副流感病毒感染宿主细胞过程中膜融合是整个过程至关重要的一个环节，由f蛋白和hn蛋白共同完成，其致病性和免疫原性等重要的生物学活性都取决于f和hn蛋白的结构和功能。所以将hn蛋白和f蛋白进行融合表达，具有重要意义。本专利技术以致病力强、感染率高，感染持续时间长的人副流感病毒3型为研究基础，通过生物信息学软件对人副流感病毒3型hn蛋白（ncbi序列号caa81294.1）和f蛋白（ncbi序列号aab21447.1）的氨基酸序列进行分析，分析结果见图1图2，对这两个蛋白的优势抗原表位进行筛选后，将这两个蛋白的优势抗原表位按进行串联，构建并合成多抗原表位融合抗原。同时，对编码该融合抗原的核苷酸序列进行密码子优化，合成该蛋白的核苷酸序列，进而构建高效原核表达载体，并进一步生产和纯化高纯度的重组蛋白。
4、具体的，所述hn蛋白片段是人副流感病毒hn蛋白的n-末端第63位到第251位的片段，f蛋白片段是人副流感病毒f蛋白第203位到第464位的片段。
5、优选地，上述两个片段是按照顺序进行排列和连接，所述人副流感病毒重组蛋白抗原，从n-末端到c-末端依次含有hn蛋白从n-末端第63位到第251位的189个氨基酸，f蛋白从n-末端第203位到第464位的262个氨基酸。两序列之间无连接肽存在。
6、第二方面，本申请还提供一种基因，该基因编码前述的人副流感病毒重组抗原。所述基因是可编码前述的人副流感病毒重组抗原的各种编码基因，根据需要转入的表达系统的差异，可对该基因进行差异化设计。因此，上述基因序列不限于如seq id no:2所示的核苷酸序列。
7、优选地，所述基因的其核苷酸序列如seq id no:2所示。该序列是基于大肠杆菌表达体系进行密码子优化后的序列，不含有大肠杆菌的稀有密码子，适合在大肠杆菌表达系统中进行表达，增加了其在大肠杆菌表达系统中表达的可能性和表达后的稳定性。
8、其他情况下，为了将上述氨基酸序列如seqidno:1所示的人副流感病毒重组蛋白抗原在其他原核或真核体系中进行工业化表达，可基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列。
9、第三方面，本申请还提供一种重组表达载体，其由表达载体和前述的人副流感病毒重组抗原的编码基因重组而成。
10、优选地，所述表达载体为pet系列表达载体，如pet-28a质粒、pet-39b或者pet-41a等。这些表达载体都适用于大肠杆菌表达体系。
11、其他情况下，基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列，表达载体可采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体。
12、第四方面，本申请还提供一种重组工程菌，其转化有前述的重组表达载体。
13、可选地，所述宿主工程菌为大肠杆菌，如大肠杆菌bl21（de3）、大肠杆菌rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株等。
14、其他情况下，表达载体采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体，宿主菌可采用与其匹配的其他大肠杆菌突变表达菌株，毕赤酵母或其他宿主。
15、第五方面，本申请还提供上述的人副流感病毒重组抗原的制备方法，其包括以下步骤：
16、（1）将前述的人副流感病毒重组抗原的编码基因的核苷酸序列连接到表达载体中，得到重组表达载体；...
【技术保护点】
1.一种人副流感病毒重组抗原，其特征在于，由HN蛋白片段和F蛋白片段组成，该抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
2.一种基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的人副流感病毒重组抗原的编码基因重组而成。
5.一种重组工程菌，其特征在于，转化有如权利要求3所述的重组表达载体。
6.如权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.一种人副流感病毒的抗体检测用组合物，其特征在于，其诊断抗原采用的是如权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原。
8.一种人副流感病毒抗体检测试剂盒，其包含如权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原。
9.根据权利要求8所述的人副流感病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括：包被有上述权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原的检测板，标记有胶体金的检测剂。
<...【技术特征摘要】
1.一种人副流感病毒重组抗原，其特征在于，由hn蛋白片段和f蛋白片段组成，该抗原的氨基酸序列如seq id no:1所示；
2.一种基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的人副流感病毒重组抗原。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的人副流感病毒重组抗原的编码基因重组而成。
5.一种重组工程菌，其特征在于，转化有如权利要求3所述的重组表达载体。
6.如权利要求1所述的人副流...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，徐建军，郭慧，孟德志，王婷，曾景斌，刘万建，
申请(专利权)人：青岛硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。