本发明专利技术公开了一种植物根肿菌响应启动子及其应用。所述植物根肿菌响应启动子为如下A1)或A2)：A1)序列表序列3所示的DNA分子；A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。通过实验证明：本发明专利技术公开的启动子包含响应根肿菌侵染的重要元件，是一个根肿菌响应启动子，该启动子对其介导根肿菌的抗性非常重要，具有重要的应用价值。
1、油菜等十字花科植物是重要的油料来源，但近年来由根肿菌引起的十字花科油料作物的病害已对其产量和品质产生了严重影响。在过去的研究中，很多植物抗病(resistance，r)基因被鉴定出来，其中大多数属于nlr基因，nlr基因含有一个核苷酸结合位点和一个亮氨酸富集序列，在植物免疫过程，特别是在eti免疫反应中起着重要作用。此外，在水稻和辣椒中还鉴定出了另外一类r基因，它们编码的蛋白能够直接杀死被病原菌感染的植物细胞，进而达到对病原菌的抗性，这类被称为执行者(executor，e)r基因。虽然nlr和executor r蛋白都能激活植物免疫，但是其激活方式截然不同。nlr蛋白通常处于自抑制状态，只有识别了病原菌的效应蛋白后，才会转换为激活状态行使功能。executor r基因是在转录水平上调控其活性，在正常条件下，executor r基因处于沉默状态；而病原菌入侵时，其效应蛋白与executor r基因的启动子结合，诱导其表达，激发植物抗病性。
2、启动子是一段位于结构基因5’端上游区的dna序列，能与rna聚合酶等转录相关蛋白准确结合，并具有转录起始的特异性，是基因表达调控的重要组成元件，控制基因表达的起始时间和表达程度。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，使基因具有时空表达特异性，因此对启动子的分离和功能分析是植物基因工程研究的重要内容。
>1、本专利技术的目的是提供一种植物根肿菌响应启动子及其应用。2、第一方面，本专利技术要求保护一种dna分子，所述dna分子为如下a1)或a2)：
3、a1)序列表序列3所示的dna分子；
4、a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的dna分子。
5、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的dna分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术提供的dna分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
6、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的dna分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
7、第二方面，本专利技术要求保护与上述dna分子相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b4)中的任一种：
8、b1)含有上述dna分子的表达盒；
9、b2)含有上述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
10、b3)含有上述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；
11、b4)含有上述dna分子的转基因植物细胞系、或含有b1)所述表达盒的转基因植物细胞系。
12、上述生物材料中，所述表达盒(5’至3’)可包括启动子区(由所述dna分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。
13、所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。
14、在制备表达盒时，可应用衔接头或联结子连接dna片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的dna、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。
15、所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本专利技术可使用任何选择性标记基因。
16、上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
17、在本专利技术的一个具体实施例中，所述重组载体为prcr1est::gus。所述prcr1est::gus为将序列3所示的dna分子连入至pcambia1300-gus载体的hindiii和xbai酶切位点间后得到的载体。
18、在本专利技术的另一个具体实施例中，所述重组载体为prcr1est::nls-3*mvenus。所述prcr1est::nls-3*mvenus为将序列3所示的dna分子连入至pgreen-nls-3*mvenus载体的hindiii和ecori酶切位点间后得到的载体。
19、在本专利技术的又一个具体实施例中，所述重组载体为prcr1est::rcrler。所述prcr1est::rcrler为将序列5所示的dna分子连入至pgreen载体的sali和xbali酶切位点间后得到的载体。
20、上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌(如农杆菌gv3101)。
21、上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述dna分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述dna分子，也可用常规育种技术将所述dna分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
22、第三方面，本专利技术要求保护上述dna分子或生物材料的新用途。
23、本专利技术要求保护上述dna分子在作为启动子或根肿菌响应启动子中的应用。
24、本专利技术要求保护上述dna分子或生物材料在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
25、本专利技术要求保护上述dna分子或生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
26、上述任一所述应用中，所述制备转基因植物或所述植物育种的目的为培育抗病植物品种(如抗根肿病植物品种)。
27、第四方面，本专利技术要求保护一种目的基因的表达方法，所述方法为如下c1)-c4)中任一种：
28、c1)包括如下步骤：以上述dna分子作为启动子或根肿菌响应启动子来启动目的基因的表达；
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【技术保护点】
1.一种DNA分子，为如下A1)或A2)：
2.与权利要求1所述DNA分子相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
3.权利要求1所述DNA分子在作为启动子或根肿菌响应启动子中的应用。
4.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
5.权利要求2所述的生物材料在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
6.权利要求1所述DNA分子在制备转基因植物或植物育种中的应用。
7.权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。
10.一种目的基因的表达方法，为如下C1)-C4)中任一种：
【技术特征摘要】
1.一种dna分子，为如下a1)或a2)：
2.与权利要求1所述dna分子相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b4)中的任一种：
3.权利要求1所述dna分子在作为启动子或根肿菌响应启动子中的应用。
4.权利要求1所述dna分子在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。
5.权利要求2所述的生物材料在启动目的基因表达或提高目的基因表达量中的应用。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：周俭民，王伟，张文静，董晓静，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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