【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及烯酰胺不对称氢化制备，尤其涉及一种光酶催化不对称还原制备(r)-n-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物的方法。
技术介绍
1、手性胺结构骨架展示出特有的理化性质和生物活性，是许多药物、天然产物和生物活性分子中的重要结构单元。开发一种高效、绿色环保的不对称合成手性胺的催化方法是药物合成领域的一项重要挑战。近年来，使用光激发酶或酶-底物复合物成为获得酶催化新功能的一种新兴策略。一方面，具有光活性的辅因子如黄素单核苷酸(fmn)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nad(p)h)或光催化剂的引入可以为酶催化过程带来全新的反应性；另一方面，酶的蛋白骨架可以通过定向进化的方法为底物提供更好的结合环境，从而实现高立体和化学选择性和高反应性。
2、烯酰胺的不对称氢化是获得手性胺的一种具有高原子经济性的高效途径。1972年，kagan团队报道了首个n-乙酰基烯酰胺的不对称氢化方法，通过铑络合物与双膦配体diop的使用，发展了一种新方法来制备对映异构体富集的乙酰胺。随后，knowles团队、noyori团队和burk团队分别引入了dipamp、binap和duphos几种手性双膦配体用于铑催化的烯酰胺不对称还原。之后数十年中，许多含手性双膦配体或单膦配体的铑催化剂被开发出来，使得烯酰胺类化合物的直接催化氢化成为合成氮原子α位或β位具有立体中心的氨基酸和手性胺的首选方法之一，在药物分子的合成中得到广泛应用。evano团队近期开发了一种conulothiazole a的全合成方法，合成分7步进行，总收率30％。其中的关键步骤之一是使用铑催化
3、目前，较为成熟的手性胺的不对称合成方法主要是通过过渡金属结合手性膦配体的使用，在氢气的参与下进行不对称催化氢化反应或不对称还原胺化反应实现。这类化学合成体系通常需要使用铑、铱等贵金属催化剂、结构复杂的手性配体以及高压氢气，面临着成本高、重金属残余等问题，在生产成本、工艺安全性方面存在一定的不足。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种光酶催化不对称还原制备(r)-n-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物的方法。本专利技术使用蓝光led激发“烯”类还原酶的辅因子fmnh-，可以显著提高该类酶的还原能力，实现对烯酰胺富电子c＝c键的还原。本专利技术所述方法实现了高收率和对映选择性的生物催化烯酰胺不对称还原反应，为手性胺的不对称合成提供一种绿色高效的生物合成新路径，在制药工业中有着潜在的重要应用前景。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种光酶催化不对称还原制备(r)-n-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物的方法，所述方法是底物烯酰胺在含有助溶剂的缓冲盐溶液中以烯类还原酶为生物催化剂，在烯类还原酶辅因子及辅因子循环系统存在下，在氮气气氛中，用led光源照射，并搅拌反应得到，其反应通式如下：
4、
5、其中：
6、ar包括苯基、c1-c6取代的苯基、α-萘基、β-萘基或杂环取代基；
7、r1选自乙酰基、叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苯甲酰基；
8、r2选自氢原子、烷基、烯丙基；
9、r3选自氢原子或烷基。
10、进一步地，所述苯基取代基(即c1-c6取代的苯基)选自卤素原子、甲氧基、甲硫基、甲基、叔丁基、三氟甲基、酯基、氰基。
11、进一步地，所述杂环取代基选自噻唑、噻吩、呋喃、苯并呋喃、苯并噻吩、吡啶等常见杂环结构。
12、进一步地，所述烯类还原酶辅因子为黄素单核苷酸钠(fmn-na)。
13、进一步地，所述辅因子循环系统包括葡萄糖脱氢酶(gdh)溶液、氧化型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)溶液和d-葡萄糖溶液。
14、进一步地，所述烯类还原酶包括oye1、oye1突变体、opr1、yerser、nostocer、ncr中的一种；所述烯类还原酶是通过e.coli bl21(de3)表达和蛋白纯化得到。
15、进一步地，所述烯类还原酶oye1突变体为与seq id no.1相比存在至少一个下述所示突变得到的突变体：f296g/f296a/f296l/y196f/y375f/f250a/f250l/f250g/n194a/f374a。即，seq id no.1的296位的苯丙氨酸被取代为甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸；196位的酪氨酸被取代为苯丙氨酸；375位的酪氨酸被取代为苯丙氨酸；250位的苯丙氨酸被取代为丙氨酸、亮氨酸或甘氨酸；194位的天冬酰胺被取代为丙氨酸；374位的苯丙氨酸被取代为丙氨酸；所述突变体是经上述突变中的一种或多种得到。
16、进一步地，所述led光源为蓝光led光源，波长为390-430nm；所述反应的时间为12-24h；所述助溶剂包括二甲基亚砜，异丙醇，乙腈或n,n-二甲基甲酰胺；所述缓冲盐溶液中助溶剂的体积比为1-10％。
17、进一步地，具体包括如下步骤；
18、(1)向反应容器中依次加入缓冲盐溶液、烯类还原酶、还原酶辅因子、葡萄糖脱氢酶(gdh)、氧化型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)、d-葡萄糖得到混合溶液，然后加入底物烯酰胺得到反应液，氮气气氛下，于led光照下室温反应12-24h；
19、(2)反应结束后，向反应容器中依次加入饱和碳酸钠溶液和乙酸乙酯萃取，得到(r)-n-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物，然后使用气相色谱(内标标准曲线法)分析反应收率，使用高效液相色谱(手性色谱柱)分析对映体选择性。
20、进一步地，步骤(1)中，所述缓冲盐包括磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、3-(n-吗啉基)丙磺酸盐、羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐或三羟甲基甲基甘氨酸盐，所述缓冲盐溶液的浓度为25-200mmol/l，ph为7.0-9.0。
21、进一步地，步骤(1)中，所述烯类还原酶相对底物的用量为0.5-3mol％；所述烯类还原酶辅因子为黄素单核苷酸钠，所述烯类还原酶辅因子相对底物的用量为0-3mol％。
22、进一步地，当烯类还原酶辅因子的浓度为0％时，反应系统中仍含有烯类还原酶自身产生烯类还原酶辅因子；
23、进一步地，当烯类还原酶辅因子溶液相对底物的用量为0.5-3％时，产率明显提升。
24、进一步地，步骤(1)中，反应液中，所述葡萄糖脱氢酶的浓度为1-20u/ml；所述氧化型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸相对底物的用量为2-20mol％；所述d-葡萄糖的当量为2-10当量；步骤(2)中，所述饱和碳酸钠溶液与乙酸乙酯的体积比为1:1-10。
25、本专利技术有益的技术效果在于：
26、本专利技术使用绿色可持续的酶催化剂，替代传统的金属催化体系，能够降低成本、简化工艺、无重金属残留等问题。
27、本专利技术的反应条件温和，常温常压下即可进行；本专利技术的底物适用范围广，多种杂环化合物都能兼容；通过定向进化可以快速获得立本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种光酶催化不对称还原制备(R)-N-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物的方法，其特征在于，所述方法是底物烯酰胺在含有助溶剂的缓冲盐溶液中，以烯类还原酶为生物催化剂，在烯类还原酶辅因子及辅因子循环系统存在下，于氮气气氛中，用LED光源照射，并搅拌反应得到，其反应通式如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，苯基取代基选自卤素原子、甲氧基、甲硫基、甲基、叔丁基、三氟甲基、酯基或氰基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂环取代基选自噻唑、噻吩、呋喃、苯并呋喃、苯并噻吩或吡啶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烯类还原酶包括OYE1、OYE1突变体、GluER、OPR1、YersER、NostocER或NCR；所述烯类还原酶OYE1是通过E.coliBL21(DE3)表达和蛋白纯化得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烯类还原酶OYE1突变体为与SEQ IDNo.1相比存在至少一个下述所示突变得到的突变体：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LED光源为蓝光LED光源
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲盐包括磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、3-(N-吗啉基)丙磺酸盐、羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐或三羟甲基甲基甘氨酸盐，所述缓冲盐溶液的浓度为25-200mmol/L，pH为7.0-9.0。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，烯类还原酶相对底物的用量为0.5-3mol％；所述烯类还原酶辅因子为黄素单核苷酸钠，所述烯类还原酶辅因子相对底物的用量为0-3mol％。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，反应液中所述葡萄糖脱氢酶的浓度为1-20U/mL；所述氧化型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸相对底物的用量为2-20mol％；反应液中所述D-葡萄糖的当量为2-10当量；步骤(2)中，所述饱和碳酸钠溶液与乙酸乙酯的体积比为1:1-10。
...【技术特征摘要】
1.一种光酶催化不对称还原制备(r)-n-乙酰基-α-芳基乙胺衍生物的方法，其特征在于，所述方法是底物烯酰胺在含有助溶剂的缓冲盐溶液中，以烯类还原酶为生物催化剂，在烯类还原酶辅因子及辅因子循环系统存在下，于氮气气氛中，用led光源照射，并搅拌反应得到，其反应通式如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，苯基取代基选自卤素原子、甲氧基、甲硫基、甲基、叔丁基、三氟甲基、酯基或氰基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂环取代基选自噻唑、噻吩、呋喃、苯并呋喃、苯并噻吩或吡啶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烯类还原酶包括oye1、oye1突变体、gluer、opr1、yerser、nostocer或ncr；所述烯类还原酶oye1是通过e.colibl21(de3)表达和蛋白纯化得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烯类还原酶oye1突变体为与seq idno.1相比存在至少一个下述所示突变得到的突变体：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述led光源为蓝光led光源，波长为...
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