【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效的基于哺乳动物细胞的蛋白进化平台。具体而言，本专利技术涉及具有单拷贝可替换序列的悬浮驯化的cho细胞株，包含活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶(aid)和单链dna结合蛋白(ssb)的融合蛋白，和包含所述cho细胞株和融合蛋白的连续高效的突变系统。
技术介绍
1、蛋白的定向进化由三个主要组成部分包括：1.突变库的构建；2.突变库的表达；和3.有效的筛选方法。通过将大容量基因突变库的构建与高效的筛选方法相结合，快速的获得具有目标性能(或功能)的突变体。如今，科学家们已经完成了各种不同蛋白的性能优化，包括酶、荧光蛋白、离子通道、抗体等等。
2、然而现阶段蛋白定向进化主要是采用非细胞系统如核糖体展示(esvelt,k.m.,carlson,j.c.,&liu,d.r.(2011).a system for the continuous directed evolutionof biomolecules.nature,472(7344),499-503.)或者微生物系统如细菌或酵母(romanini,d.w.,peralta-yahya,p.,mondol,v.,&cornish,v.w.(2012).a heritablerecombination system for synthetic darwinian evolution in yeast.acs syntheticbiology,1(12),602-609.)完成。尽管这些系统具有高通量、高效率、低成本等优势，但是通过这类技术路线得到的
3、因此，开发高效的基于哺乳动物细胞的定向进化技术，具有重要的意义及广阔的应用前景。与其他系统类似，基于哺乳动物细胞的定向进化技术同样分为三个部分：突变库的构建，突变库的表达以及有效的筛选方法。
4、突变库的构建可采用细胞外人工构建和细胞内突变两种途径。其中胞外人工构建包括易错pcr(error-prone pcr，参见如cirino,p.c.,mayer,k.m.,&umeno,d.(2003).generating mutant libraries using error-prone pcr.directed evolution librarycreation:methods and protocols,3-9.)和易突变菌株(mutator strains of bacteria，参见如muteeb,g.,&sen,r.(2010).random mutagenesis using a mutator strain.invitro mutagenesis protocols:third edition,411-419.)等方法产生随机突变文库或者通过人工设计构建定点突变文库以及合成文库。通过这些方法构建的大容量突变库，随后可采用病毒感染、转座子、重组酶介导的基因定点插入、以及基于crispr/cas9系统的高效同源重组修复等技术高效的转入细胞内表达。但是这些技术存在着效率不够高(小规模测试时可以达到20％左右的效率，但是放大规模后其效率会直线下降至5％左右的低效率)，细胞内多拷贝基因表达，转录表达不均一，难以扩大规模，成本高等问题。
5、因此，科学家们建立了各种细胞内连续突变法用于解决这些问题。细胞内突变法的基本原理是在细胞内诱导目的基因产生突变，在细胞培养扩大的过程中形成突变库。主要方法包括：基于脱氨基酶的体细胞超突变(somatic hypermutation，参见例如odegard,v.h.,&schatz,d.g.(2006).targeting of somatic hypermutation.nature reviewsimmunology,6(8),573-583.)、基于crispr的定点突变(crispr-based dna targeting，参见例如pickar-oliver,a.,&gersbach,c.a.(2019).the next generation of crispr–castechnologies and applications.nature reviews molecular cell biology,20(8),490-507.)、基于rna聚合酶的持续突变(highly processive rna polymerases，参见例如moore,c.l.,papa iii,l.j.,&shoulders,m.d.(2018).a processive protein chimeraintroduces mutations across defined dna regions in vivo.journal of theamerican chemical society,140(37),11560-11564.)和病毒辅助的突变(viralreplication)。尽管上述技术能更为精确地提高目的区域或者目的基因的突变率，但这些技术存在着突变率还不够高，表达不均一和多突变体在一个细胞中等不同问题。
6、另外，现有技术中常用的细胞系并不是最为常用的药物表达细胞系中国仓鼠卵巢细胞(cho)，而是采用更易于转染和aid诱导突变的细胞系如k562，293t等。然而这些细胞系耐受较差，构建单拷贝、稳定、均一的目的蛋白高表达细胞株也费时费力，难以高密度培养以及蛋白修饰等问题，限制了这些系统的效率及应用范围。
7、现阶段70％以上的动物细胞表达药物产品以cho细胞作为表达宿主，相比于其他细胞系，cho细胞易于培养以及基因操作，具有与人天然抗体相近的糖基化修饰、能够高效扩增和表达外源基因，可以贴壁和悬浮两种培养方式，具有较高的耐受性，易于高密度培养等优点。基于cho细胞的连续突变系统用于蛋白进化，更有利于后期的表达和开发，具有很大的发展潜力和应用前景。
技术实现思路
1、技术问题
2、本专利技术旨在解决现有技术中构建突变库时存在的突变率低、表达不均一、难以构建单拷贝稳定细胞株、细胞株应用范围受限以及突变细胞株耐受性差的问题。
3、技术解决方案
4、本专利技术人以cho细胞为基础，结合重组酶介导的盒式交换技术，单链dna结合蛋白的dna结合特性，以及活化诱导的脱氨基酶催化dna突变的性质，构建了一个哺乳动物细胞内连续高效的突变系统。
5、第一方面，本专利技术提供了一种具有单拷贝可替换序列的悬浮驯化的cho细胞株，所述可替换序列插入到cho基因组中的稳定表达位点，目的基因能够通过重组酶介导的盒式交换替换所述可替换序列。
6、在一个实施方式中，所述悬浮驯化的cho细胞株为cho-s细胞株。
7、在一个实施方式中，其中所述稳定表达位点位于seq id no：1所示的基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有单拷贝可替换序列的悬浮驯化的CHO细胞株，所述可替换序列插入到CHO基因组中的稳定表达位点中，目的基因能够通过重组酶介导的盒式交换替换所述可替换序列。
2.根据权利要求1所述的CHO细胞株，其中所述稳定表达位点位于SEQ ID NO：1所示的ASC-2基因座中或与其距离不超过10kb、5kb、1kb、500bp或100bp。
3.根据权利要求1或2所述的CHO细胞株，其中所述可替换序列通过CRISPR-Cas9系统介导的同源定向修复插入到CHO基因组中的稳定表达位点，其中所述同源定向修复通过gRNA1或其功能性变体或者gRNA2或其功能性变体靶向所述稳定表达位点，所述gRNA1或其功能性变体包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的靶向序列，所述gRNA2或其功能性变体包含与SEQ ID NO：3具有至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的靶向序列。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的CHO细胞株，其中所述可替换序列包含选择标记和所述选择标记两侧的重组酶识别位点，所述选择标记
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的CHO细胞株，其中所述CHO细胞株的培养密度大于109个细胞/升，优选大于1010个细胞/升。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的CHO细胞株，其中转入携带目的基因的载体后，在2天的时间内获得目的基因的稳定、均一、高表达CHO细胞株。
7.一种融合蛋白，其包含活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶(AID)和单链DNA结合蛋白(SSB)。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述AID来源于脊椎动物，优选来源于智人(Homo sapiens)，更优选是野生型智人AID或其功能性片段或功能性变体，最优选与SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少97％的同一性、至少99％的同一性或100％的同一性。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述AID还在对应于SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的第9、13、38、42、96、115、132、157、180、181、183、197、198或其组合的位点上包含一个或多个氨基酸替换，例如选自K10E、K34E、K34D、T82I、T82L、F115E、E156G、E156A和R174E的氨基酸替换。
10.根据权利要求7至9中的任一项所述的融合蛋白，其中所述SSB来源于细菌，优选来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，更优选是野生型大肠杆菌SSB或其功能性片段或功能性变体，最优选与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少97％的同一性、至少99％的同一性或100％的同一性。
11.根据权利要求7至10中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还在所述AID和SSB之间包含一个或多个接头，例如GS接头，优选(GGGGS)n，n为1至10的整数。
12.根据权利要求7至11中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还在所述AID和SSB之间包含一个或多个核定位信号，例如SV40 NLS。
13.根据权利要求7至12中的任一项所述的融合蛋白，其中所述AID经由接头和/或核定位信号或直接连接至所述SSB的N端。
14.根据权利要求7至13中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO：10或与其具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的核苷酸序列编码。
15.一种突变系统，其包含根据权利要求1至6中的任一项所述的CHO细胞株和根据权利要求7至14中的任一项所述的融合蛋白。
16.根据权利要求15所述的突变系统，其中所述融合蛋白通过瞬时转染携带编码所述融合蛋白的核苷酸序列的载体在所述CHO细胞株中表达。
17.根据权利要求1至6中的任一项所述的CHO细胞株、根据权利要求7至14中的任一项所述的融合蛋白或根据权利要求15或16所述的突变系统用于构建目的基因的突变体库、用于表达目的基因的突变体库或用于筛选目的基因的突变体的用途，所述目的基因编码例如为荧光蛋白或抗体。
18.一种通过根据权利要求15或16所述的突变系统筛选到的目的基因的突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种具有单拷贝可替换序列的悬浮驯化的cho细胞株，所述可替换序列插入到cho基因组中的稳定表达位点中，目的基因能够通过重组酶介导的盒式交换替换所述可替换序列。
2.根据权利要求1所述的cho细胞株，其中所述稳定表达位点位于seq id no：1所示的asc-2基因座中或与其距离不超过10kb、5kb、1kb、500bp或100bp。
3.根据权利要求1或2所述的cho细胞株，其中所述可替换序列通过crispr-cas9系统介导的同源定向修复插入到cho基因组中的稳定表达位点，其中所述同源定向修复通过grna1或其功能性变体或者grna2或其功能性变体靶向所述稳定表达位点，所述grna1或其功能性变体包含与seq id no：2具有至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的靶向序列，所述grna2或其功能性变体包含与seq id no：3具有至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的靶向序列。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的cho细胞株，其中所述可替换序列包含选择标记和所述选择标记两侧的重组酶识别位点，所述选择标记优选为抗生素抗性基因例如嘌呤霉素抗性基因，所述重组酶识别位点优选选自frt、f3或其组合。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的cho细胞株，其中所述cho细胞株的培养密度大于109个细胞/升，优选大于1010个细胞/升。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的cho细胞株，其中转入携带目的基因的载体后，在2天的时间内获得目的基因的稳定、均一、高表达cho细胞株。
7.一种融合蛋白，其包含活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶(aid)和单链dna结合蛋白(ssb)。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中所述aid来源于脊椎动物，优选来源于智人(homo sapiens)，更优选是野生型智人aid或其功能性片段或功能性变体，最优选与seq idno：7所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性、至少80％的同一性、至少90％的同一性、至少95％的同一性、至少97％的同一性、至少99％的同一性或100％的同一性。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述aid还在对应于seq id no：7所示的氨基酸序列的第9、13、38、4...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈川，彭健，
申请(专利权)人：华深智药生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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