【技术实现步骤摘要】
本申请涉及肿瘤基因治疗领域，具体地，本申请提供了一种多基因表达的慢病毒及其制备方法和应用
技术介绍
1、癌症是全球主要的公共卫生问题，近年来全球癌症发病率不断增长。癌症的治疗是一道世界性的难题，传统的治疗方法只能进行手术、放疗、化疗，因其副作用大，给病人带来了巨大的痛苦。近几年随着精准医疗技术的发展，越来越多的可用靶点被发现，开启了癌症的精准治疗时代。虽然，新的疗法如pd-1、pd-l1，car-t等不断涌现，但pd-1、pd-l1因其靶点单一，治疗局限性大，对实体瘤治疗效果不佳；car-t主要针对白血病的治疗，治疗方式通过血液全身给药，对实体瘤治疗效果不佳。
2、慢病毒载体(lentivirus vector，lvs)是hiv-1(人类免疫缺陷i型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒既可感染有丝分裂活跃期的细胞，又可感染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞、神经干细胞、处于分化终末的神经元、肝实质细胞等。在体外培养细胞实验和体内移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以得到长期而稳定的表达。此外，慢病毒载体不表达任何hiv-i蛋白，免疫原性低。经过改造后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因，因此大多数的cdna都能被克隆入慢病毒载体。这些优点使慢病毒载体成为体内和体外基因转移的一种有效工具。目前，一般构建慢病毒载体目的基因都为一个启动子加一个目的基因。其外源基因碱基数都在1000bp左右。而随着研究的深入，发现单一外源目的基因无法解决的问题，就需要加入复合的外源基因来辅助解决这一个问题。
技术实现思路
1、本专利是将人工合成的复合基因htert-cdc6shrna-cmv-p16-pten-p53(碱基数5188bp)构建到慢病毒载体上。htert端粒酶是一种rna依赖性的dna聚合酶，其核心结构包含必要的rna结构，由逆转录活性的人端粒酶亚单位(human telomerase catalyticsubunit,htert)和相关蛋白组成。htert启动子区域缺乏tata盒及caat盒，其结构是富含gc的cpg岛，转录起始位点上游181bp是核心启动子区，多个转录因子结合位点。在成熟分化的人类组织细胞中htert基因的表达处于关闭状态，在肿瘤细胞中该基因在转录水平上被激活。所以通过htert基因的启动子可以特异性地引导肿瘤基因只在肿瘤细胞中表达。癌细胞中含有大量正常细胞中所没有的cdc6蛋白，且癌细胞的细胞分裂越大，cdc6蛋白的含量越高。“cdc6shrna活性基因”的使用原理着眼于这种“癌症有无限增殖”的特性，它能消灭在普遍癌细胞里存在的一种被称为cdc6的dna的复制因子，敲低cdc6蛋白，然后通过p16来修复抑癌基因rb路径上的起效机制，并促使癌细胞在刚开始增殖阶段即停止增殖。接着是激活被称为基因守护神的pten和p53基因，使之有效地让癌细胞走向自我灭亡，并通过lentivirus vector对癌细胞进行高效渗透使原癌基因与发生突变、缺失或失活的抑癌基因恢复其正常的调节作用，癌细胞恢复为正常细胞，从而实现抑制肿瘤的目的。通过体外实验的结果，我们发现这种复合基因的组合具有明显的抑癌效果。
2、一方面，本申请提供了一种多基因表达的慢病毒，所述多基因表达的慢病毒携带有htert启动子、cdc6shrna基因、cmv启动子、p16基因、pten基因和p53基因。
3、进一步地，所述htert启动子序列为seq id no.2。
4、进一步地，所述cdc6shrna基因序列为seq id no.3。
5、进一步地，所述cmv启动子序列为seq id no.4。
6、进一步地，所述p16基因序列为seq id no.5。
7、进一步地，所述pten基因序列为seq id no.6。
8、进一步地，所述p53基因序列为seq id no.7。
9、进一步地，所述多基因表达的慢病毒携带htert-cdc6shrna-cmv-p16-pten-p53组合基因。
10、进一步地，所述htert-cdc6shrna-cmv-p16-pten-p53组合基因序列为seq idno.1。
11、另一方面，本申请提供了上述多基因表达的慢病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。
12、进一步地，所述癌症为甲状腺癌。
13、另一方面，本申请提供了药物组合物，所述药物组合物包含上述多基因表达的慢病毒。
14、进一步地，所述药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂。
15、进一步地，所述药物组合物为注射剂剂型。
16、另一方面，本申请提供了上述多基因表达的慢病毒的制备方法:
17、(1)在载体的酶切位点后插入htert启动子、cdc6shrna基因和cmv启动子、p16基因、pten基因、p53基因序列，获得质粒；
18、(2)将质粒转入表达菌株，培养筛选成功转入的菌株；
19、(3)对步骤(2)所得的成功转入的菌株进行摇菌，得到
20、htert-cdc6shrna-cmv-p16-pten-p53多基因表达质粒；
21、(4)对步骤(3)所述多基因表达质粒进行包装，得到htert-cdc6shrna-cmv-p16-pten-p53多基因表达慢病毒。
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1.一种多基因表达的慢病毒，其特征在于，所述多基因表达的慢病毒携带有hTERT启动子、CDC6shRNA基因、CMV启动子、P16基因、PTEN基因以及P53基因。
2.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述hTERT启动子序列为SEQ IDNO.2。
3.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述CDC6shRNA基因序列为SEQ IDNO.3。
4.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述CMV启动子序列为SEQ IDNO.4。
5.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述P16基因序列为SEQ ID NO.5。
6.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述PTEN基因序列为SEQ IDNO.6。
7.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述P53基因序列为SEQ ID NO.7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的多基因表达的慢病毒，其中所述多基因表达的慢病毒携带hTERT-CDC6shRNA-CMV-P16-PTEN-P53组合基因。
...【技术特征摘要】
1.一种多基因表达的慢病毒，其特征在于，所述多基因表达的慢病毒携带有htert启动子、cdc6shrna基因、cmv启动子、p16基因、pten基因以及p53基因。
2.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述htert启动子序列为seq idno.2。
3.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述cdc6shrna基因序列为seq idno.3。
4.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述cmv启动子序列为seq idno.4。
5.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述p16基因序列为seq id no.5。
6.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述pten基因序列为seq idno.6。
7.根据权利要求1所述的多基因表达的慢病毒，其中所述p53基因序列为seq id no.7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的多基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：张力辉，荆淑清，
申请(专利权)人：青岛阿尔泰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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