【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于对大分子的表面进行地图绘制(kartieren)的方法。在此，大分子尤其、但不排他性地理解为蛋白质和蛋白质复合物。令人感兴趣的表面是蛋白质的所谓的三级结构的和复合物的所谓的四级结构的重要部分。对表面进行地图绘制主要涉及对其三维走向的确定。此外，对具有特定的化学特性和/或物理特性的区域的位态(lage)进行确定。总而言之，目标可以是，识别并且表征位于大分子的表面上的、用于其他的分子或者大分子的结合位置。
技术介绍
1、用于确定大分子的结构的已知方法是x射线结构分析。所述方法需要培养(züchten)大分子的晶体。即，不但需要存在大量大分子，而且这些大分子还必须为此已被排列在晶格中。遗憾的是，很多大分子不能够结晶，或者晶体的培养是非常耗时且昂贵的。即使结晶成功，也存在大分子的结构通过结晶被改变的危险。此外，虽然通过x射线结构分析获得关于蛋白质的三级结构或者复合物的四级结构的信息，但是通常不能够实现其表面的完整的地图绘制。
2、另外已知的是，借助核磁共振光谱学(nmr光谱学)确定大分子的结构。为此，不需要大分子的晶体。但是，也仅获得关于在大分子中的单个化学元素的核的环境的信息，并且未获得关于大分子的表面的走向的直接说明。在此，开销也是非常高的。
3、蛋白质的结构也能够借助冷冻电子显微镜(kryo-em)确定。在所述方法中，记录电子的大量图像，所述电子在很多单个的蛋白质或者蛋白质复合物上被散射，并且借助计算机算法对所述图像如此求平均，使得所述结构显露出来。为了实现期望的结构，所述方法需要高分
4、另外已知的是，借助人工智能，基于蛋白质的一级结构、即蛋白质的氨基酸序列和具有已知氨基酸序列的其他大分子的结构信息，预测蛋白质的三级结构。例如由google公司的计算机程序alphafold做出这样的基于人工智能的预测。所预测的三级结构至少到目前为止仍然具有大的误差。不直接确定所述三级结构，而是仅基于可信度观察来估计所述三级结构。
5、此外，这些已知的方法都不适合用于直接在活细胞中对蛋白质的表面进行地图绘制。通过已知的方法所提供的信息仅间接地涉及大分子的令人感兴趣的表面。其直接涉及大分子的原子结构，所述原子结构单独地还不允许做出关于大分子在其原生环境中的实际结合能力的陈述。
技术实现思路
1、本专利技术基于如下任务：阐明一种用于对大分子的表面进行地图绘制的方法，所述方法消除所提到的缺点。
2、其他现有技术
3、由ep 3 055 674 b1已知一种用于将样品成像的方法，其中，将样品中的荧光微粒布置在荧光激发光的光强度分布的空间受限的最小值中，并且利用光强度分布的最小值来跟踪样品中的微粒的运动。为此，使光强度分布在样品中如此运动，使得由微粒发射的荧光光子的速率保持最小。光强度分布的最小值在样品中的当前位置等同于微粒在样品中的当前位置。由此，对于样品的多个区域中的每个区域确定微粒的驻留时间，并且将驻留时间在样品上的分布成像。所述方法可以借助不同的荧光微粒执行，所述荧光微粒可以借助不同波长的荧光激发光被激发成荧光。对于多个荧光微粒中的每个荧光微粒，也可以借助荧光激发光的相同波长或者不同波长执行所述已知的方法。另外，可以将能够被光活化的荧光体用作荧光微粒。
4、由ep 3 372 989 a1已知一种用于空间上测量纳米级结构的方法。用荧光标记在不同位置处标记所述结构。在荧光抑制光的强度分布的局部最小值中，用激发光激发荧光标记，用以发射荧光。在此，局部最小值布置在样品中的近距离范围中的不同位置上，所述近距离范围的尺寸不大于在激发光的波长和荧光的波长的情况下的衍射极限。针对各个荧光标记以及针对最小值的不同位置分开地记录从样品发射出的荧光；以及从针对相应的荧光标记针对最小值的不同位置记录的荧光的强度，确定各个荧光标记在样品中的位置。
5、由ep 3 523 631 b1已知用于高空间分辨率地确定样品中的经分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法，所述方法也被称为minflux。使激励光以具有局部最小值的强度分布对准样品。所述最小值布置在分子附近的不同位置上。由分子的发光的在此所记录的强度确定分子在样品中的位置。借助这些已知的方法，能够以在0.5与20nm之间的范围中的精度确定分子在样品中的位置。已知的方法可以用于追踪在样品中运动的分子、即在时间上跟踪所述分子的位置。
6、由m.weber等人的《minsted nanoscopy enters the angstrom localizationrange》，https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.18.484906v1，已知一种被称为minsted的方法，其中，借助荧光激发光和荧光抑制光的经叠加的强度分布，确定经分离的荧光分子的位置，如由sted扫描荧光显微镜已知的那样。但是，不是以荧光抑制光的零点和荧光激发光的与此叠加的焦点扫描所述样品，而是将零点布置在待定位的分子的环境中的各个快速改变的位置上。基于2000个在此记录的荧光光子，可以以如下精度确定荧光分子的位置：所述精度的简单标准差(或一倍标准差，einfache standardabweichung)小于0.5nm。
7、解决方案
8、本专利技术的任务通过具有独立权利要求1的特征的用于对大分子的表面进行地图绘制的方法解决。在从属权利要求中限定根据本专利技术的方法的优选的实施方式。
9、本专利技术的说明
10、为了以根据本专利技术的方式对大分子的表面进行地图绘制，将至少一个荧光探针(fluoreszente sonde)引入到介质中，大分子已经嵌入到所述介质中，或者与至少一个荧光探针一起或还稍晚被嵌入到所述介质中。通过定位经分离(vereinzelten)的至少一个荧光探针，以不大于2nm的简单标准差，确定至少一个荧光探针相对于大分子的多个空间位置，其中，记录由经分离的荧光探针发射的荧光光子。然后，确定界面，所述界面界定所确定的相对于大分子的空间位置。由所述界面创建大分子的表面的至少一部分的三维地图。
11、作为介质(大分子嵌入到所述介质中)，根据本专利技术的方法可以利用例如在细胞、甚至活细胞中大分子的自然环境。替代地，所述介质涉及这样的介质：特别是为了执行根据本专利技术的方法而将所述大分子嵌入到所述介质中。在任何情况下，将至少一个荧光探针引入到介质中。在此，至少一个荧光探针应理解为至少一个单个的荧光单元。通常，将多个这样的荧光单元同时或者相继地引入到介质中，因为为了创建三维地图必须以高精度确定至少一个荧光探针相对于大分子的多个空间位置，为此，需要来自至少一个荧光探针的多个光子。因此，存在如下危险：相应的荧光探针被永久地光化学地退变(geb本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于对大分子(1)的表面(3)进行地图绘制的方法，所述方法具有下述步骤
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述至少一个荧光探针(4)的如此多的空间位置，使得在所述大分子(1)的表面(3)上所确定的空间位置(27)的平均表面密度为每100平方纳米至少25个或者至少50个或者至少100个或者至少200个位置。
3.根据权利要求1或者2所述的方法，其特征在于，沿着所述界面检测所确定的空间位置(27)的局部表面密度，并且将所述局部表面密度录入到所述三维地图(30)中。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在创建所述三维地图(30)时，考虑所述至少一个荧光探针(4)的特性，所述特性是从如下组中选择的：所述组包括所述至少一个荧光探针(4)的尺寸和所述至少一个荧光探针(4)对所述表面(3)的特定区域的物理亲和力和/或化学亲和力。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，由所确定的空间位置(27)和所述至少一个荧光探针(4)的特性推导出用于具有预给定的物理亲和力和/或化学亲和力的分子的结合亲和力和/或结合常数，
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个荧光探针(4)设有亲和基团(11)，如此选择所述亲和基团，使得所述亲和基团对具有特定的化学特性和/或物理特性的大分子(1)的表面(3)的特定区域(6、8)具有增加的或者排他性的亲和力。
7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述大分子(1)的空间位态
8.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过借助MinFlux或者MinSTED的定位，执行对经分离的至少一个荧光探针(4)相对于所述大分子(1)的多个空间位置的确定。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过设定所述至少一个荧光探针(4)在所述介质(2)中的低的空间浓度，使所述至少一个荧光探针(4)分离。
10.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过在所述介质(2)中相对于所述大分子(1)的相对运动，到达所述至少一个荧光探针(4)的空间位置。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
12.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过使包含在所述介质(2)中的全部数量的相同荧光探针(4)的变化的子集分离，到达所述至少一个荧光探针(4)的空间位置。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离
14.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将对所述大分子(1)的表面(3)的不同区域具有不同亲和力的不同荧光探针(4'、4")引入到所述介质(2)中，其中，分开地进行对多个空间位置的确定，并且可选地，对于所述不同荧光探针(4'、4")，分开地进行对界定所述空间位置的界面的确定。
15.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
16.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在由所述界面创建所述大分子(1)的表面(3)的至少一部分的三维地图(30)时，考虑关于所述大分子(2)的现有的结构信息。
17.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于对大分子(1)的表面(3)进行地图绘制的方法，所述方法具有下述步骤
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，确定所述至少一个荧光探针(4)的如此多的空间位置，使得在所述大分子(1)的表面(3)上所确定的空间位置(27)的平均表面密度为每100平方纳米至少25个或者至少50个或者至少100个或者至少200个位置。
3.根据权利要求1或者2所述的方法，其特征在于，沿着所述界面检测所确定的空间位置(27)的局部表面密度，并且将所述局部表面密度录入到所述三维地图(30)中。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在创建所述三维地图(30)时，考虑所述至少一个荧光探针(4)的特性，所述特性是从如下组中选择的：所述组包括所述至少一个荧光探针(4)的尺寸和所述至少一个荧光探针(4)对所述表面(3)的特定区域的物理亲和力和/或化学亲和力。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，由所确定的空间位置(27)和所述至少一个荧光探针(4)的特性推导出用于具有预给定的物理亲和力和/或化学亲和力的分子的结合亲和力和/或结合常数，并且将所述结合亲和力和/或结合常数录入到所述三维地图(30)中。
6.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个荧光探针(4)设有亲和基团(11)，如此选择所述亲和基团，使得所述亲和基团对具有特定的化学特性和/或物理特性的大分子(1)的表面(3)的特定区域(6、8)具有增加的或者排他性的亲和力。
7.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述大分子(1)的空间位态
8.根据上述权...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·W·黑尔，
申请(专利权)人：马克斯普朗克科学促进学会，
类型：发明
国别省市：
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