【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体地，涉及一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体nb y-2-2-4及其应用。
技术介绍
1、抑霉唑(imazalil，imz)，又名烯菌灵，属于咪唑类杀菌剂，是一种广谱性的内吸式杀菌剂。通过抑制真菌羊毛甾醇-14α-去甲基酶(cyp51)的合成，抑制麦角甾醇生物合成中的去甲基化反应，造成14α-去甲基醇的蓄积，从而抑制细胞膜麦角固醇的合成，使得细胞膜通透性改变，破坏细胞壁的合成造成真菌死亡，达到抑菌效果，起到保护农作物的作用。imz对于侵袭水果、蔬菜、谷物等的许多真菌病害具有防治效果，尤其是柑橘、香蕉等水果经喷洒等处理后能有效防治收获后的腐烂，用于防治水果蔬菜的真菌危害。如对于柑橘采后感染的绿色霉菌和蓝色霉菌具有良好的防治作用，实现抑菌保鲜的作用，故而得到广泛应用。但是不合理使用、错误使用现象时有发生，对人类健康和环境安全具有潜在危害性，如细胞毒性、生殖毒性、dna损伤和神经毒性。
2、imz因其应用广泛性，检出率较高，易存在超标风险，建立一种快速、灵敏、高效的检测方法对果蔬等农产品中的农药残留进行监测，是确保符合监管要求、遵守良好农业规范和进口国规定贸易要求的关键工具。
3、目前，对于食品中imz残留检测方法有仪器分析方法和免疫分析方法等。仪器分析方法作为目前食品安全中的主流检测方法，是测定食品中imz残留并确定食品安全性的标准方法，具有较高的灵敏度，并且准确度高、重复性好，但是操作复杂、前处理繁琐，需要高技术人才，并且仪器价格昂贵，成本较高，以上客观性因素导致其无法实时现场快速检测。免
4、在免疫分析方法中，抗体的稳定性起着十分关键的作用。抗体是免疫分析方法的核心，目前免疫分析检测主要大多依赖于单克隆抗体作为识别元件，由于抗体的本质是蛋白质，其活性会影响检测结果的准确度和灵敏度。在实际应用时，生物识别材料容易受储藏和运输条件影响而失活，且在样品前处理阶段往往需要有机溶剂进行处理，有机溶剂的残留会使得检测效果大大降低，而单克隆抗体的有机耐受性及酸碱耐受性都较差。更重要的是，单克隆细胞在传代过程中的遗传稳定性不能确定，和从动物中分离单克隆抗体增加了制备成本。
5、纳米抗体是一种新型的基因工程抗体，来源于驼科动物，是小的抗原结合片段，其晶体直径仅为2.5nm，长4nm，分子量只有15kda左右，称为vhh或纳米抗体。与传统抗体相比，纳米抗体缺乏fc区，从而避免了与非靶物质结合引起的假阳性结果。此外，它们可以通过原核表达大规模生产，具有很高的抵抗变性剂的能力，并且可以通过基因工程进行改造结构。这些特性使纳米抗体在免疫检测方法中具有潜在的价值，更能满足市场对快检的需求。酶联免疫分析(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)作为快检技术，前处理方法多以有机溶剂直接提取，纳米抗体优越的有机溶剂耐受性使得其在快检中具有较好的应用前景。目前仍未见特异性识别抑霉唑的纳米抗体的开发与应用，因此基于纳米抗体来研发一种稳定性好、准确度高、灵敏度强的快速检测抑霉唑的方法具有很好的应用价值。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体nb y-2-2-4。
2、本专利技术的第二个目的在于提供编码所述纳米抗体nb y-2-2-4的基因。
3、本专利技术的第三个目的是提供一种重组载体。
4、本专利技术的第四个目的是提供一种重组细胞。
5、本专利技术的第五个目的是提供所述纳米抗体nb y-2-2-4、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测抑霉唑中的应用。
6、本专利技术的第六个目的是提供所述纳米抗体nb y-2-2-4、所述基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备检测抑霉唑的产品中的应用。
7、本专利技术的第七个目的是提供一种抑霉唑检测试剂盒。
8、本专利技术的第八个目的是提供一种检测抑霉唑的免疫检测方法。
9、本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
10、本专利技术首先提供一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体nb y-2-2-4，所述纳米抗体nby-2-2-4的氨基酸序列如seq id no.1所示。
11、本专利技术通过制备人工抗原免疫羊驼获得纳米抗体基因文库，通过用噬菌体展示技术，经过生物淘筛，从羊驼免疫抗体基因文库中筛选得到了一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体nb y-2-2-4。该纳米抗体nb y-2-2-4的制备方法简单，具有普遍适用性，可用于其他小分子物质纳米抗体的筛选和制备，具有较高应用价值。
12、进一步地，所述纳米抗体nb y-2-2-4包括4个框架区fr1、fr2、fr3、fr4和3个互补决定区cdr1、cdr2、cdr3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4；其中，所述fr1的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述fr2的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述fr3的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述fr4的氨基酸序列如seq idno.5所示，所述cdr1的氨基酸序列如seq id no.6所示，所述cdr2的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述cdr3的氨基酸序列如seq id no.8所示。
13、本专利技术提供编码所述纳米抗体nb y-2-2-4的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
14、本专利技术提供一种重组载体，所述重组载体含有上述所述基因。
15、本专利技术还提供一种重组细胞，所述重组细胞含有所述重组载体。由于本专利技术已给出了纳米抗体nb y-2-2-4的氨基酸序列和编码该纳米抗体的基因序列，本领域技术人员可在此基础上通过已知的重组dna技术得到本申请所述纳米抗体。因此，任何可用于制备本专利技术所述纳米抗体的重组载体或重组细胞等也应在本专利技术的保护范围之内。
16、进一步地，本专利技术对所述纳米抗体nb y-2-2-4进行检测性能及耐受性分析，结果表明，基于纳米抗体建立elisa检测方法，该方法对抑霉唑检测范围为3.70～20.65ng/ml，半抑制浓度(ic50)为8.74ng/ml,最低检测限(lod)为1.85ng/ml，检测灵敏度高。纳米抗体nby-2-2-4的抗原结合活性在20％以下的甲醇、乙醇和乙腈溶液中仍维持80％以上的活性，在40％的甲醇和乙醇中仍保持一半的活性，具有优异的有机溶剂耐受性；nb y-2-2-4在适宜的酸性环境中(ph＝2.4～6.4)结合活性会更佳，甚至提高到150％。在碱性仍有较高的活性，甚至在ph＝12.4，活性仍保持60％左右，具有优异的酸碱性耐受性。以上结果表明纳米本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体Nb Y-2-2-4，其特征在于，所述纳米抗体Nb Y-2-2-4的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述纳米抗体Nb Y-2-2-4的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述纳米抗体Nb Y-2-2-4、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在非诊断目的的检测抑霉唑中的应用。
6.权利要求1所述纳米抗体Nb Y-2-2-4、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在制备检测抑霉唑的产品中的应用。
7.一种用于检测抑霉唑的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述纳米抗体Nb Y-2-2-4。
8.一种非诊断目的的检测抑霉唑的免疫检测方法，其特征在于，用抑霉唑半抗原与载体蛋白偶联得到的完全抗原做包被原，用
9.根据权利要求8所述免疫检测方法，其特征在于，，所述抑霉唑半抗原的结构式如式(I)所示：
10.根据权利要求8所述免疫检测方法，其特征在于，所述载体蛋白为卵清白蛋白。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性识别抑霉唑的纳米抗体nb y-2-2-4，其特征在于，所述纳米抗体nb y-2-2-4的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.编码权利要求1所述纳米抗体nb y-2-2-4的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.9所示。
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述基因。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述重组载体。
5.权利要求1所述纳米抗体nb y-2-2-4、权利要求2所述基因、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在非诊断目的的检测抑霉唑中的应用。
6.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾羲，胡凌，黄穗东，毛新武，王宇，易云婷，罗鼎峰，韦海燕，朱亮宇，
申请(专利权)人：广州市食品检验所广州市酒类检测中心，
类型：发明
国别省市：
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