【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及生产p34hb的菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
1、石化塑料与人们的日常生活密切相关，发挥着十分重要的作用。然而，其降解过程至少需要200年才能完成。因此，废弃塑料污染已经成为继空气污染、水污染之后的第三大污染问题，不断威胁着人类的生活环境。聚羟基脂肪酸酯（pha）作为一种全生物合成和全生物降解的生物塑料，具有良好的材料学性能，被广泛用于医疗器械、包装、纺织等多领域的应用研究。近几年来出现的由3-羟基丁酸（3hb）和4-羟基丁酸(4hb）共同聚合的共聚物聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯（poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，简称p34hb）是目前pha家族中最好的一种pha之一，已受到人们的广泛关注。由于其良好的生物相容性和热稳定性，p34hb可用于生物医用材料，生物可降解材料以及纺织纤维等。
2、基因工程改造是提高pha生产效率的重要手段。通过基因编辑技术，可以对微生物的代谢途径进行优化，增强关键酶的活性，增加pha的合成速率和产量。尽管微生物发酵生产pha具有广阔的前景，但仍面临一些挑战，包括生产成本高，对于一些优质pha如p34hb的产量及4hb等单体含量较低以及微生物的代谢工程改造难度大等。
3、因此，亟需一种高产可同时提高p34hb的产量及p34hb中4hb的含量的方法，降低菌株发酵的生产成本，以满足产业化需求。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本专利
2、本专利技术提供一种生产聚（3-羟基丁酸酯- co-4-羟基丁酸酯）的菌株的构建方法，包括如下步骤：
3、s1：体外构建含基因a、基因b、 ogda基因和 orfz基因核苷酸序列的重组载体；
4、s2：将s1所述重组载体导入菌株中；
5、其中，基因a为 4hbd基因或 4hbd突变体，所述 4hbd突变体与 4hbd基因的区别在于以下任意一项：
6、（i）第77个碱基由g替换为a，第188个碱基由c替换为g；
7、（ii）第739个碱基由g替换为a；
8、（iii）第574个碱基由g替换为c；
9、（iiii）第757个碱基由c替换为a；
10、（iiiii）第660个碱基由g替换为t；
11、基因b为 sucd基因或 sucd突变体，所述 sucd突变体与 sucd基因的区别在于以下任意一项：
12、（1）第56个碱基由0a替换为c；
13、（2）第270个碱基由a替换为t；
14、（3）第287个碱基由t替换为c；
15、（4）第543个碱基由a替换为c；
16、（5）第62个碱基由t替换为g，第1223个碱基由c替换为a；
17、（6）第755个碱基由c替换为t；
18、所述 sucd基因的核苷酸序列如seq id no. 23所示，所述 4hbd基因的核苷酸序列如seq id no. 19所示。
19、进一步的，所述菌株为盐单胞菌。
20、进一步的，所述盐单胞菌为halomonas lutescensmdf-9。
21、进一步的，s1所述重组载体为pseva载体，优选为pseva321。
22、进一步的，所述重组载体中含有启动子，所述启动子为porin启动子。
23、本专利技术还提供一种菌株，由所述的构建方法得到。
24、本专利技术还提供一种使用所述的菌株生产聚（3-羟基丁酸酯- co-4-羟基丁酸酯）方法，包括如下步骤：
25、（1）菌种活化；
26、（2）摇瓶种子培养；
27、（3）摇瓶发酵培养。
28、进一步的，所述步骤（3）中发酵培养的温度为36~38℃。
29、进一步的，所述步骤（3）中发酵培养的ph为8~12。
30、进一步的，所述步骤（3）中发酵培养的时间为36~72 h。
31、综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
32、本专利技术以盐单胞菌为底盘菌，通过对从葡萄糖到4-羟基丁酰基辅酶a的途径的基因进行改造，在琥珀酸半醛和4-羟基丁酸脱氢酶的特定位点进行突变，提升了菌株对p34hb的生产效率，同时提高p34hb中4hb的含量，具有潜在的产业化潜力。
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1.一种生产聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述菌株为盐单胞菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述盐单胞菌为HalomonaslutescensMDF-9。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1所述重组载体为pSEVA载体。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体中含有启动子，所述启动子为porin启动子。
6.一种菌株，其特征在于，由权利要求1~5任意一项所述的构建方法得到。
7.一种使用权利要求6所述的菌株生产聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养的温度为36~38℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养的pH为8~12。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发
...【技术特征摘要】
1.一种生产聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述菌株为盐单胞菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述盐单胞菌为halomonaslutescensmdf-9。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，s1所述重组载体为pseva载体。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体中含有启动子，所述启动子为porin启动子。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶健文，吕金艳，司徒卫，余柳松，林艺娜，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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