【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测领域，具体涉及基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒。
技术介绍
1、alv属于反转录病毒科，甲型逆转录病毒属。特点是发病呈散发性(发病率为3％—25％)，1911年，alv首次在英国被rous发现，此后，全球鸡场大范围都检测出来alv的存在，alv感染会引起鸡的免疫抑制病，抑制其生长，并且会诱发肿瘤导致死亡，死亡率达到1％-2％，有些环境较差的鸡场甚至可以达到20％。尽管历经了一个多世纪的研究，但是至今仍然没有疫苗可以保护鸡免受alv的感染。
2、根据宿主范围不同以及不同毒株之间的相互作用以及病毒囊膜糖蛋白的抗原构造，将alv分为11个亚群(a-k)，其中，e亚群属于内源性alv，不具有致病性或者致病性很低。1991年，payne发现并分离了禽白血病病毒的新亚群并将其命名为j亚群，j亚群可在鸡中诱导多种类型的肿瘤，主要诱发骨髓细胞样肿瘤，与禽白血病病毒(alv)的其他亚群不同，alv-j的传染性和致病性都比经典的a、b、c、d亚群alv高得多。在上世纪90年代中期，就已经传至全球所有国家几乎所有的白羽肉鸡群。给全球养禽业带来了极大的损失。alv-j的传播方式是水平传播和垂直传播，一旦种鸡场出现了禽白血病病毒j亚型(alv-j)且未能及时净化，所有的父母代和商品代鸡群都有可能被感染。这种情况会导致病毒在整个鸡群中迅速传播，对养殖业造成严重的经济损失和公共卫生风险。因此，及时检测和净化alv-j对保障鸡群健康和维持生产效益至关重要。
3、因此，鉴于alv-j感染引
4、crispr是有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)。crispr/cas系统是古细菌的自我保护机制，叫做适应性免疫系统，于1987年首次被发现。因成分和作用机制的不同将crispr系统分为两类：一类系统由多蛋白复合效应物组成，二类系统由单一效应蛋白组成。一类系统包括ⅰ、ⅲ和ⅳ型，二类系统包括ⅱ、ⅴ和ⅵ型，截止目前，至少有26种亚型被发现。而且不同类型和亚型正在快速扩展中。两种ii类rna引导的核酸内切酶已被用作于生物传感器，它就是cas12a和cas13a，分别靶向单链或者双链dna和单链rna。cas13与crrna形成复合物识别靶向ssrna，从而激活cas13a蛋白中的hpen结构域，可以切割环境中的一切ssrna。
5、由于crispr-cas13a检测的特异性切割功能以及便利性，该系统已被应用于检测各种疾病以及一些生物标志物，zhengfeng等利用crispr-cas13a这种信号转导过程开发出来一种用于靶核酸检测的sherlock系统，用来特异性检测寨卡病毒。crrna决定了crispr检测的特异性，parinaz fozouni等人设计结合sars-cov-13病毒rna多个区域的crrna提高了crispr检测的灵敏度；此外，使用侧向层析也实现了基于crispr/cas13a系统对niv病毒的检测以及对家禽腺病毒的血清检测。为了解决rna扩增过程中的背景影响，parinazfozouni等人开发了一种无需扩增的crispr/cas13a检测方法，利用手机显微镜在30分钟内就可以读取检测结果，更加方便快捷。
6、与传统的pcr和qpcr分子诊断病毒方法相比，crispr方法在敏感性，易操作度和经济性方面表现出优势。
7、鉴于crispr-cas13a系统在上述多种病毒检测中的成功应用，推测该系统也可以有效用于检测禽白血病病毒j亚型(alv-j)。通过设计特异性的crrna，crispr-cas13a系统能够识别并切割探针rna，提供快速、灵敏和经济的检测方法。这不仅有助于及时发现和控制alv-j的传播，还能显著降低检测成本，尤其适用于资源有限的偏远地区。
8、因此，亟需利用crispr系统开发了一种两管式检测方法，用于检测alv-j。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒，本专利技术利用alv-j全基因组env序列中的gp85基因设计crrna，以最大限度地提高其在所有alv-j分离株或变异株中的特异性；本专利技术的目的之二在于提供所述试剂盒在检测体外禽白血病j亚型中的应用。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒，所述试剂盒包括raa扩增试剂和t7转录酶的crispr-cas13a检测试剂；
4、所述raa扩增试剂含有如seq id no.1与seq id no.2，seq id no.4与seq idno.5或seq id no.8与seq id no.9所示引物对；
5、所述t7转录酶的crispr-cas13a检测试剂包括t7转录酶、cas13a、荧光报告基因、crrna引物；所述荧光报告基因的序列如seq id no.23所示；所述crrna引物如seq idno.13与seq id no.14，seq id no.17与seq id no.18或seq id no.21与seq id no.22所述。
6、本专利技术优选的，所述raa扩增试剂还包括reactive powder、rna样品、a buffer和bbuffer。
7、本专利技术优选的，所述t7转录酶的crispr-cas13a检测试剂还包括buffer，rna抑制剂，rntp，hepes，mgcl2和rna targrt，所述rna targrt为raa扩增产物。
8、本专利技术优选的，所述试剂盒还包括侧向层析试纸条，所述试纸条包括结合垫区域、检测区和控制区，所述结合垫区域固定6-fam-uuuuuuuuuuuuuu-c6 biotin rna探针，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于CRISPR/Cas13a系统快速检测禽白血病J亚型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括RAA扩增试剂和T7转录酶的CRISPR-Cas13a检测试剂；
2.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas13a系统快速检测禽白血病J亚型的试剂盒，其特征在于：所述RAA扩增试剂还包括Reactive Powder、RNA样品、A buffer和B buffer。
3.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas13a系统快速检测禽白血病J亚型的试剂盒，其特征在于：所述T7转录酶的CRISPR-Cas13a检测试剂还包括Buffer，RNA抑制剂，rNTP，HEPES，MgCl2和RNA Targrt，所述RNA Targrt为RAA扩增产物。
4.根据权利要求1所述基于CRISPR/Cas13a系统快速检测禽白血病J亚型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括侧向层析试纸条，所述试纸条包括结合垫区域、检测区和控制区，所述结合垫区域固定6-FAM-UUUUUUUUUUUUUU-C6 Biotin RNA探针，所述检测区包括T线，T线固定有捕获分子，
5.根据权利要求4所述基于CRISPR/Cas13a系统快速检测禽白血病J亚型的试剂盒，其特征在于：所述捕获分子为链霉亲和素或亲和素。
6.权利要求1～5任一项所述试剂盒在检测体外禽白血病J亚型中的应用。
...【技术特征摘要】
1.基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括raa扩增试剂和t7转录酶的crispr-cas13a检测试剂；
2.根据权利要求1所述基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒，其特征在于：所述raa扩增试剂还包括reactive powder、rna样品、a buffer和b buffer。
3.根据权利要求1所述基于crispr/cas13a系统快速检测禽白血病j亚型的试剂盒，其特征在于：所述t7转录酶的crispr-cas13a检测试剂还包括buffer，rna抑制剂，rntp，hepes，mgcl2和rna targrt，所述rna targrt为raa扩增产物。
4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈述涛，兰茜，谭敏，张誉，周欣怡，廖如玉，李宇航，刘澄，刘欣雨，王海威，王启贵，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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