【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫组化检测，具体为免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法。
技术介绍
1、肝脏在解剖上拥有双重供血系统，除了获得营养和氧气外，通过门静脉系统获得从肠道来源的细菌和其毒素，以及通过肝动脉获得的富含抗原的血液，经过肝窦被一系列抗原递呈细胞和淋巴细胞所获取，然后展开一系列复杂的免疫应答。生理状态下，肝脏在人体内合成各种物质，能把体内有毒物质转换成无毒物质，对维持人体生命活动正常运转发挥重要作用，同时肝脏中富含大量免疫细胞，如kupffer细胞，还有淋巴细胞、自然杀伤细胞等参与人体免疫反应，它们共同组成人体对外界的屏障。重要的是，生理状态下肝脏处于抗炎状态或免疫耐受状态，免疫力和耐受性之间的平衡对肝功能至关重要。由于门脉血也运输大量外来但无害的分子(如食物抗原)，肝脏能对这些大分子保持免疫耐受，然而在有害抗原物质刺激下，肝脏能够建立迅速而强大的免疫反应将其清除。维持某种平衡和整体组织的健康关键靠肝脏中免疫细胞群之间分工明确又动态相互作用。肝脏似乎被设计用于检测、捕获和清除细菌、病毒和大分子，基于对肝脏特殊功能的认识，细菌很难突破这道防线，肝脏过去通常被人们认为是一个无菌的器官。
2、随着对肠肝轴的内在联系认识逐渐深入，人们发现肠道菌群这个“隐形的器官”对肝脏疾病发生发展发挥着重要作用。人们发现细菌及其产物可以通过薄弱的肠道屏障进入肠肝循环中，这种能力与细菌毒素及肠壁的渗透性密切相关，更多的内毒素甚至细菌才能通过门静脉到达肝脏。除门脉系统以外，肠系膜淋巴系统也为病原体提供了活动场所，它们在那里启动适应性免疫反应，最
3、随着16s rdna测序和宏基因组测序技术的发展，肝脏的微生物组成逐渐被重新认识。andré等对北美白足鼠肝脏组织进行16s rrna测序，在属水平发现乳杆菌属占优势，其次是巴尔通体属、葡萄球菌属和孪生球菌属。joshua为了验证肝脏细菌的来源是肠道微生物群这一假设，研究者选择口服荧光标记的牙龈卟啉单胞菌，之后检测其在肠道和肝脏中的丰度。假设得到了验证，牙龈假单胞菌易位到肝脏，线性回归分析表明，尽管胃和十二指肠中牙龈假单胞菌的丰度随时间变化有所下降，但其在肝脏中的丰度仍保持稳定。为了测试肠道微生物是否会具有选择性，研究者将来自特定无病原体供体小鼠的粪便微生物移植给无菌小鼠。在无菌小鼠中，粪菌移植的实验数据表明肝脏微生物组是受肠道选择性地给予的影响。在16s rdna测序数据β多样性分析中，人类肝脏微生物群比肠道分散聚集；此外，与小鼠中的发现类似，拟杆菌门(bacteroidetes)在肝脏中的丰度明显高于肠道，而厚壁菌门(firmicutes)则减少。同样α多样性分析显示，与肠道菌群相比，人类肝脏中的微生物丰富度明显较低，基于shannon和simpson指数的均匀度也有所下降，这再次与研究者在小鼠中的发现的结果相似。研究数据表明，人类肝脏中存在一种富含变形菌门(proteobacteria)的微生物群，这与肠道菌群特点不同。这些证据为肝脏微生物研究提供了参考。
4、由于肿瘤组织的内在特征，肿瘤组织可能具备支持细菌侵入、存活和生长的多种内在条件。这些条件包括：(1)肿瘤内部的缺氧环境，有利于兼性和严格厌氧菌的生长；(2)肿瘤内部坏死组织给细菌生长提供了充足的营养供应(比如嘌呤物质)，有利于细菌繁殖，同时坏死区域出现的化学信号也促进细菌外渗；(3)围绕肿瘤周围出现很多新生血管，这些渗漏的血管网络很容易被循环细菌用于进入组织的通道；(4)由于肿瘤的免疫耐受，定植细菌逃避宿主免疫监视而轻松繁殖。所有这些因素都可能共同促成肿瘤内微生物群的形成。事实上肿瘤内细菌已被报道存在于许多肿瘤类型中，在黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、骨肉瘤、卵巢癌等人类肿瘤类型都有肿瘤内微生物存在的证据，无论是位于肿瘤组织的外周，还是深入组织的内部。这些微生物不仅可能影响肿瘤的生长和进展，也可能影响治疗效果以及影响患者的预后，其作用不能再被忽视。目前对肝细胞癌(hcc)中细菌研究甚少，尚未见用免疫组化证明肝细胞癌中存在细菌成分的报道，肝细胞癌缺乏预后预测指标，常规免疫组化步骤无法检测到lps的表达，所以我们提出了免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，包括如下步骤：
3、步骤1、切片：病理蜡块连续切片，厚度4μm；
4、步骤2、拷片：将切片放摊片机上37℃烤片30min后放65℃烤箱1h；
5、步骤3、脱蜡：将切片放入切片架，置入含二甲苯盒内，进行脱蜡，每缸10min，共3次；
6、步骤4、水化：将切片用无水乙醇ⅰ浸没5min、90％乙醇ⅱ浸没3min、80％乙醇iii浸没3min、蒸馏水浸没3min×2缸；
7、步骤5、抗原修复：将配好的tris-edta加入装有切片的缸内，待高压锅加水煮沸后放入，待温度上升到120℃后持续3min；
8、步骤6、自然条件降温10min后，打开高压锅，将切片过2缸蒸馏水，每缸3min，用免疫组化笔对组织外缘画圈；
9、步骤7、阻断内源性过氧化物酶：切片上滴加3％过氧化氢阻断，平放于装少量蒸馏水的湿盒上避光37℃烤箱孵育8min，过2缸蒸馏水，每缸3min；
10、步骤8、孵一抗：用一抗稀释液(安必平)配置一抗(lps，hycult biotech，货号30443m1220)，根据组织大小将配好比例的一抗滴加50-100μl于组织上，平放于装少量蒸馏水的湿盒上37℃孵育35min；
11、步骤9、洗涤一抗：pbst洗涤5min×3次；
12、步骤10、孵二抗：滴加50-100μl鼠兔同用二抗于组织上，37℃烤箱孵育10min；
13、步骤11、洗涤二抗：pbst洗涤5min×3次；
14、步骤12、显色：按照dab显色说明书(roche,k27151)配置显色液，按需滴于组织上并镜下观察，根据染色深浅调整染色时间，将切片放蒸馏水中终止显色1min，自来水冲洗2min；
15、步骤13、复染及返蓝：切片放入含mayer苏木素染色液缸内，缓慢摇晃切片并染色30s，自来水冲洗10min；
16、步骤14、脱水：将切片用100％乙醇浸泡10min×2缸，二甲苯浸泡30min×2缸，此步骤为使玻片背景透明；
17、步骤15、使用中性树胶封片；
18、步骤16、显微镜镜检，图像采集，使用image j定量分析免疫组化结果。...
【技术保护点】
1.免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于：所述的步骤5中，TRIS-EDTA为pH 8.0，采用高温高压抗原修复法。
3.根据权利要求1所述的免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于：所述的步骤8中，一抗稀释液采用安必平，以1：400的比例进行稀释。
4.根据权利要求1所述的免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于：所述的步骤10中，二抗采用Roche，k27081：k27082按照1：1配置。
【技术特征摘要】
1.免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的免疫组化检测肝细胞癌内内毒素的方法，其特征在于：所述的步骤5中，tris-edta为ph 8.0，采用高温高压抗原修复法。
3.根据权利要求1所述的免疫组化...
【专利技术属性】
技术研发人员：张良杰，张勇，李伟，陈慧娟，李娜，李冬冬，张嫚利，
申请(专利权)人：蚌埠医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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