【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于纯化抗体的方法，所述方法包括有限数量的步骤，同时仍允许以优异的纯度水平获得高产率的经纯化抗体。简而言之，此方法仅包括过滤和沉淀步骤，而省略了对层析步骤的需要。
技术介绍
1、抗体纯化可能是生物生产中最昂贵的方面之一。抗体(ab)及其片段通常使用多步骤层析方法来纯化，在每个层析步骤中使用特定的树脂和缓冲液系统。此常规纯化方法包括捕获步骤，随后是离子交换步骤，并且以uf/df步骤结束。随着细胞培养滴度的增加和将用于生产的细胞培养体积的增加，下游加工被视为工业的瓶颈。这与单克隆抗体(mab)生产特别相关，在单克隆抗体生产中，重点已从批量容量转移到下游加工能力。此外，早期的临床前和临床阶段研究需要更大量的可以更快地生产的抗体。另外，层析步骤是决定商品成本(cog)的最重要因素之一。
2、本行业探索了减少用于抗体纯化的步骤数量。
3、wo 2011/090719公开了用于纯化抗体的方法，所述方法包括2个或3个层析步骤，第一层析步骤涉及使用蛋白a柱，第二层析步骤涉及使用阳离子交换层析柱，并且任选的第三层析步骤涉及使用阴离子交换层析柱。
4、wo 2009/111347公开了在比蛋白a柱洗脱缓冲液中常规使用的ph高的ph下装载多模式树脂层析，这表明需要在两个层析步骤之间交换缓冲液。
5、wo 2014/180852涉及使用由母液制成的四种缓冲溶液对蛋白质(特别是mab)进行小规模和大规模纯化的3步层析方法。
6、wo 2013/075740描述了仅使用由母液制成的4
7、wo 2010/056550描述了尤其使用2个层析步骤的纳米抗体纯化方法。
8、层析步骤在抗体纯化中的广泛使用可以通过此方法在经纯化产物的品质上的成功来解释，所述纯化产物最终可能用于人类。因此，优选的是，任何新的纯化方法都必须保持允许最终产品用于人类的品质。
9、将层析步骤的数量减少到只有2个驱使加工时间和cog下降。
10、然而，仍然需要优化抗体纯化，如进一步降低抗体生产和加工时间的cog，同时优选地保持品质。
技术实现思路
1、从宿主细胞中纯化目的蛋白(如ab)的问题是巨大数量和大小的杂质。这些杂质可能大于目的蛋白，小于目的蛋白，或者甚至与目的蛋白具有相同的大小。这使得纯化过程成为一项具有挑战性的任务，这同时通过冗长且昂贵的层析方法来解决。
2、诸位专利技术人已发现了一种用于纯化抗体的新方法，所述方法包括有限数量的步骤，同时仍允许以优异的纯度水平获得高产率的经纯化抗体。简而言之，此方法仅包括过滤和沉淀步骤。在证明了在获得经纯化蛋白方面的适宜性后，诸位专利技术人还表明所述方法可容易地扩展。本专利技术的纯化方法的商品成本大大低于常规层析方法。实际上，按比例放大到100l已比可比的层析方法便宜86％。另外，通过使用仅需要更换盒和缓冲液的单个切向流过滤装置可以进一步简化所述方法。为了进一步最小化cog，可以最小化dv步骤的数量，同时维持所需的纯度水平。
3、本质上，本专利技术的用于从溶液中纯化蛋白质的方法基本上包括：
4、(a)第一过滤步骤，其中将所述目的蛋白与较大杂质分离；
5、(b)第二过滤步骤，其中将所述目的蛋白与较小杂质分离；
6、(c)沉淀、洗涤和重悬浮步骤，其中将所述目的蛋白与任何其他剩余的杂质分离；以及
7、(d)超滤/渗滤(uf/df)步骤，其中将所述目的蛋白在主缓冲液中浓缩。
8、接下来，所述主缓冲液可以通过根据所述经纯化蛋白的具体需要(如冻干、施用等)添加赋形剂来容易地调整。如果需要，可以过滤所得经配制蛋白以进行长期储存(任选的步骤(e))。
9、具体地，本专利技术涉及一种用于从溶液中纯化蛋白质的方法，所述方法包括：
10、(a)第一过滤步骤，其包括：(i)使所述溶液通过第一膜，从而产生第一渗透物，其中所述第一膜具有在40kda与100kda之间、优选在40kda与80kda之间、甚至更优选50kda标称截留分子量(nmwco)的孔径；
11、(b)第二过滤步骤，其包括：(i)使用第二膜浓缩在步骤(a)结束时获得的第一渗透物，从而产生包含所述蛋白质的第一渗余物，其中所述第二膜具有在2kda与50kda之间、如在4kda与40kda之间、在6kda与30kda之间、在8kda与20kda之间、更优选10kda或15kdanmwco的孔径；
12、(c)沉淀、洗涤和重悬浮步骤，其包括：(i)沉淀在步骤(b)结束时获得的包含所述蛋白质的所述第一渗余物，直到形成包含所述蛋白质的沉淀物；(ii)使用第三膜洗涤包含所述蛋白质的所述沉淀物；(iii)重悬浮在步骤(c)(ii)结束时获得的经洗涤沉淀物，从而产生包含所述蛋白质的第二渗余物；(iv)通过第三膜过滤在步骤(c)(iii)结束时获得的包含所述蛋白质的第二渗余物，从而产生包含所述蛋白质的第二渗透物，其中所述第三膜具有在0.05-0.35μm之间、如0.1-0.3μm或者在0.15-0.25μm之间、如0.2μm的孔径；
13、(d)超滤/渗滤(uf/df)步骤，其包括：(i)使用第四膜渗滤在步骤(c)结束时获得的包含所述蛋白质的第二渗透物，从而产生包含所述蛋白质的第一渗滤物，其中所述第四膜具有在2kda与50kda之间、如在4kda与40kda之间、在6kda与30kda之间、在8kda与20kda之间、更优选10kda或15kda nmwco的孔径；(ii)使用所述第四膜浓缩在步骤(d)(i)结束时获得的包含所述蛋白质的第一渗滤物，从而产生包含所述蛋白质的第三渗余物；(iii)使用所述第四膜渗滤步骤(d)(ii)的包含所述蛋白质的第三渗余物，从而产生包含所述蛋白质的第二渗滤物；
14、(e)任选的配制和最终过滤步骤，其包括：(i)在配制缓冲液中配制在步骤(d)结束时获得的包含所述蛋白质的所述第二渗滤物，从而产生包含所述蛋白质的经配制产物；和(ii)任选地过滤所述经配制产物；
15、其中所述蛋白质具有在5kda-200kda之间的分子量(mw)，优选地所述蛋白质具有在10kda与150kda之间、优选在15kda与100kda之间、甚至更优选在15kda与50kda之间、如在15kda-30kda之间、如约15kda或20kda的mw。
16、本专利技术还涉及一种如本文所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一过滤步骤(a)、和/或所述第二过滤步骤(b)、和/或所述沉淀步骤(c)(i)、和/或所述洗涤步骤(c)(ii)、和/或所述重悬浮步骤(c)(iii)、和/或所述过滤步骤(c)(iv)、和/或所述渗滤步骤(d)(i)、和/或所述浓缩步骤(d)(ii)和/或所述渗滤步骤(d)(iii)以切向流过滤(tff)或通过正向流过滤(nff)实施，优选地所有步骤(a)、(b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于从溶液中纯化蛋白质的方法，所述蛋白质是包含免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)的多肽，所述溶液获自在宿主或宿主细胞中表达所述蛋白质，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一过滤步骤(a)、所述第二过滤步骤(b)、所述沉淀步骤(c)(i)、所述洗涤步骤(c)(ii)、所述重悬浮步骤(c)(iii)、所述过滤步骤(c)(iv)、所述渗滤步骤(d)(i)、所述浓缩步骤(d)(ii)和所述渗滤步骤(d)(iii)以切向流过滤(TFF)实施，优选地所有步骤(a)、(b)、(c)(i)、(c)(ii)、(c)(iii)、(c)(iv)、(d)(i)、(d)(ii)和(d)(iii)在同一个装置中实施。
3.根据权利要求1或2所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一膜、和/或所述第二膜、和/或所述第三膜、和/或所述第四膜包含改性聚醚-砜(mPES)、再生纤维素、聚丙烯、醋酸纤维素、聚乳酸、陶瓷聚醚-砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(PVDF)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中在所述第一渗透物中有在50％-100％之间、如在60％-100％之间、或甚至在80％-100％之间的所述蛋白质被回收。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中包含所述蛋白质的所述第一渗透物包含比所述溶液少10％-100％的杂质，如比所述溶液少20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、或甚至80％-100％的杂质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第二过滤步骤(b)包括使用纯化水。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中将所述第一渗余物中的蛋白质浓缩至在50-200mg/ml之间、如75-175mg/ml或者在100-150mg/ml之间、如约120mg/ml或125mg/ml的浓度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述沉淀通过包含沉淀剂的沉淀溶液实施，所述沉淀剂选自可混溶溶剂、非离子亲水聚合物、多价金属离子如Ca2+、Mg2+、Mn2+或Fe2+以及中性盐、优选稳液剂、最优选((NH4)+)2(SO4)2-。
10.根据权利要求9所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述沉淀以1.4-2.2M、如1.6-2.0M、优选约1.8M的((NH4)+)2(SO4)2-实施。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中步骤(c)(ii)的包含所述蛋白质的所述沉淀物的洗涤包括用洗涤溶液代替所述沉淀溶液，并且优选地用2-8个DV、如4-6个DV或5个DV的洗涤溶液洗涤所述沉淀物，优选地所述洗涤溶液包含浓度在1.4-2.2M之间、如1.6-2.0M、优选约1.8M的沉淀剂，优选地所述沉淀剂是((NH4)+)2(SO4)2-。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中将在步骤(c)(ii)结束时获得的经洗涤的沉淀物重悬浮于包含浓度在0.8-0.4M之间、如0.7-0.5M、优选约0.6M的沉淀剂的重悬浮溶液中，优选地所述沉淀剂是((NH4)+)2(SO4)2-。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中将在步骤(c)结束时获得的包含所述蛋白质的所述第二渗透物利用在1-4个渗滤体积(DV)之间、如1个DV的主缓冲液进行渗滤。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第三渗余物中的蛋白质的浓度在10-100mg/ml之间、如25-80mg/ml或者在40-60mg/ml之间、如约50mg/ml或55mg/ml。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中将在步骤(d)(ii)结束时获得的包含所述蛋白质的所述第三渗余物用1-8个渗滤体积(DV)、如3-6个、或者4个DV或5个DV的主缓冲液进行渗滤。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述经配制的产物包含
...【技术特征摘要】
1.一种用于从溶液中纯化蛋白质的方法，所述蛋白质是包含免疫球蛋白单可变结构域(isvd)的多肽，所述溶液获自在宿主或宿主细胞中表达所述蛋白质，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一过滤步骤(a)、所述第二过滤步骤(b)、所述沉淀步骤(c)(i)、所述洗涤步骤(c)(ii)、所述重悬浮步骤(c)(iii)、所述过滤步骤(c)(iv)、所述渗滤步骤(d)(i)、所述浓缩步骤(d)(ii)和所述渗滤步骤(d)(iii)以切向流过滤(tff)实施，优选地所有步骤(a)、(b)、(c)(i)、(c)(ii)、(c)(iii)、(c)(iv)、(d)(i)、(d)(ii)和(d)(iii)在同一个装置中实施。
3.根据权利要求1或2所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一膜、和/或所述第二膜、和/或所述第三膜、和/或所述第四膜包含改性聚醚-砜(mpes)、再生纤维素、聚丙烯、醋酸纤维素、聚乳酸、陶瓷聚醚-砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏二氟乙烯(pvdf)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第一过滤步骤(a)包括用2-4个渗滤体积(dv)、如3个dv的纯化水过滤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中在所述第一渗透物中有在50％-100％之间、如在60％-100％之间、或甚至在80％-100％之间的所述蛋白质被回收。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中包含所述蛋白质的所述第一渗透物包含比所述溶液少10％-100％的杂质，如比所述溶液少20％-100％、30％-100％、40％-100％、50％-100％、60％-100％、70％-100％、或甚至80％-100％的杂质。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中所述第二过滤步骤(b)包括使用纯化水。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其中将所述第一渗余物中的蛋白质浓缩至在50-200mg/ml之间、如75-175mg/ml或者在100-150mg/ml之间、如约120mg/m...
【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·卡斯特尔，威廉·凡德威尔德，安东尼·凡德皮特，辛迪·德弗里兹，
申请(专利权)人：埃博灵克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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