氨基酸诊断／测定试剂（盒）及氨基酸的浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、高铁细胞色素Ｃ、氯化钙、氨基酸脱氢酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的程度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定

技术介绍
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(CoupleReaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术氨基酸浓度测定方法如下：氨基酸+水+辅酶   氨基酸脱氢酶  含氧酸+氨+还原型辅酶氨+2水+6高铁细胞色素c亚硝酸还原酶/Ca2+亚硝酸+                                 6亚铁细胞色素c亚硝酸+水+辅酶  硝酸还原酶  硝酸+还原型辅酶这种方法应用氨基酸脱氢酶(amino-acid dehydrogenase；EC 1.4.1.5；EC1.4.99.1)酶(偶)联亚硝酸还原酶(nitrite reductase；EC 1.7.2.2)、硝酸还原酶(nitrate reductase；EC 1.7.1.1；EC 1.7.1.2；EC 1.7.99.4)酶促反应比色法。氨基酸脱氢酶酶解氨基酸反应产生氨，同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，再通过(偶)联合亚硝酸还原酶、硝酸还原酶的作用，第二次将辅-->酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算氨基酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术氨基酸诊断/测定试剂(盒)较为理想：缓冲液    100mmol/L稳定剂          500mmol/L辅酶            3mmol/L氨基酸脱氢酶    10000U/L亚硝酸还原酶    12000U/L硝酸还原酶      12000U/L高铁细胞色素C   5mmol/L氯化钙          6mmol/L本专利技术的氨基酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸脱氢酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氯化钙。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、高铁细胞色素C、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶。辅酶、氨基酸脱氢酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氯化钙在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、高铁细胞色素C、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶。试剂3缓冲液、稳定剂、氨基酸脱氢酶。辅酶、氨基酸脱氢酶、亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、高铁细胞色素C、氯化钙在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定氨基酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。-->具体实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L稳定剂                           500mmol/L辅酶                             3mmol/L氨基酸脱氢酶                     10000U/L亚硝酸还原酶                     12000U/L硝酸还原酶                       12000U/L高铁细胞色素C                    5mmol/L氯化钙                           6mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出氨基酸的浓度大小。实施例二本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L稳定剂                           50mmol/L辅酶                             3mmol/L高铁细胞色素C                    5mmol/L氯化钙                           6mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L稳定剂                           50mmol/L氨基酸脱氢酶                     10000U/L亚硝酸还原酶                     12000U/L硝酸还原酶                       12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法如下：氨基酸＋水＋辅酶氨基酸脱氢酶含氧酸＋氨＋还原型辅酶氨＋２水＋６高铁细胞色素ｃ亚硝酸还原酶／Ｃａ↑［２＋］亚硝酸＋６亚铁细胞色素ｃ亚硝酸＋水＋辅酶硝酸还原酶硝酸＋还原型辅酶将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的程度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】
1.一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法如下：氨基酸+水+辅酶氨基酸脱氢酶含氧酸+氨+还原型辅酶氨+2水+6高铁细胞色素c  亚硝酸还原酶/Ca2+亚硝酸+                                          6亚铁细胞色素c亚硝酸+水+辅酶硝酸还原酶硝酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。2.一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：缓冲液             20——500mmol/L稳定剂             1——4000mmol/L辅酶               1——6mmol/L氨基酸脱氢酶       1000——80000U/L亚硝酸还原酶       1000——80000U/L硝酸还原酶         1000——80000U/L高铁细胞色素C      1——50mmol/L氯化钙             1——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3.根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：由缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]