【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut及其制备方法，属生物。
技术介绍
1、食线虫性真菌（nematophagous fungi，ntf）对维持土壤生态系统中线虫的动态平衡起着重要作用。目前，已发现不同种类的食线虫性真菌约700种，它们能够捕捉线虫（幼虫，成虫和虫卵），并将其作为自身的营养物质。根据对线虫的作用机制，通常将食线虫性真菌分为4大类：即捕食线虫性真菌、内寄生性真菌、机会真菌以及产毒素杀线虫性真菌。目前，化学驱虫药物的广泛使用已造成诸多问题，如线虫产生耐药性、药物残留、生态环境污染等，因此利用线虫的天敌--捕食线虫性真菌及其侵染性蛋白酶研发杀线虫的新型生物防控制剂具有重要的应用前景。
2、捕食线虫性真菌不仅可以捕捉线虫作为自身的营养物质，而且对维持天然环境中线虫种群密度的动态平衡起重要的作用。捕食线虫性真菌对环境的适应性和灵活的生活方式使其成为防控动物寄生线虫的理想生物制剂。捕食线虫性真菌是通过孢子、菌丝或菌丝末端侵染线虫、虫卵或囊胞的一类杀线虫性真菌。该类真菌主要分布于真菌界（ eumycota）的子囊菌门（ ascomycota）、担子菌门（ basidioymcota）、接合菌门（ zygomycota）等，大多属于节丛孢属（ arthrobotrys）、掘氏霉属（ drechslerella）、亚隔指孢属（
3、几丁质（chitin）是线虫体壁和虫卵外壳的重要组成部分，由n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的高分子生物多聚体，其结构坚硬，在线虫和虫卵抵抗外界不良环境过程中起关键性作用。在捕食线虫过程中，捕食线虫性真菌可分泌一些水解酶（几丁质酶、丝氨酸蛋白酶和胶原蛋白酶等），其中几丁质酶能破坏几丁质中的β-1，4糖苷键，并将线虫体壁或虫卵卵壳水解成n-乙酰基-β-d-葡萄糖，因此几丁质酶在真菌穿透、附植和消化线虫过程中发挥了重要的作用。
4、目前，根据氨基酸序列的同源性可将几丁质酶分为ⅰ～ⅴ种类型，其中ⅰ、ⅱ、ⅳ型属于几丁质酶19家族，主要存在于高等植物中，而ⅲ、ⅴ型属于几丁质酶18家族，主要存在于植物和真菌中。根据酶与底物发生反应的不同位置、降解后产生的产物可以将几丁质酶划分为以下三类：（1）几丁质内切酶（endochitinase，ec3.2.1.14）：沿着几丁质链随机进行切割糖苷键，生成二聚体（二乙酰基壳二糖）和由 glcnac 组成的可溶性低分子量多聚体，如壳三糖和壳寡糖。（2）几丁质外切酶（exochitinase）：可从糖链的非还原端开始裂解几丁质或几丁质寡聚物，生成单体 n-乙酰葡糖胺(glcnac)，也是唯一能水解(glcnac)2 的酶。（3）裂解多糖单加氧酶（lpmo）：属于具有水解多糖能力的糖苷水解酶，隶属于糖苷水解酶家族（glycoside hydrolase family）。
5、 虽然不同真菌来源的几丁质酶在氨基酸序列上存在较大差异，但大多数几丁质酶具有相似的结构域，从n端到c端依次为：信号肽（signal peptide，sp）、几丁质结合结构域（chitin-binding domain，cbd）、催化结构域（catalyticdomain）、插入结构域（insertion domain，cid）和lysm结构域（lysm domain）等。少孢节丛孢菌是捕食线虫性真菌的代表菌之一，也是目前分子生物学背景研究最为深入的捕食线虫性真菌。研究发现，少孢节丛孢菌在侵染和降解线虫过程中，可产生多种几丁质酶（至少16种），它们在分子结构和生物学功能方面存在着差异。几丁质酶在水解几丁质的过程中，催化结构域起关键性作用。同源性比较发现，几丁质酶具有高度保守的催化域区段lisxggw和dxxdxdxe，然而在保守催化域中的glu对催化反应至关重要。此外，在不同营养环境中少孢节丛孢菌不同的几丁质酶表达水平也存在明显的差异。相关研究表明，几丁质结合结构域（cbd）主要存在一个能够与非溶性几丁质结合的位点，可增强真菌几丁质酶对非溶性几丁质的水解，使几丁质酶的水解功能增强。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut及其制备方法，利用expasy分子生物学软件对少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190和ao-223基因及其编码蛋白进行分子结构特征分析。在保留了几丁质酶ao-190几丁质酶保守域的基础上，为增加其几丁质结合能力，在其n端用连续的3段柔性肽[（gggggs）3]连接几丁质酶ao-223几丁质结合结构域，构建ao-190mut融合基因片段，以确保各结构域功能独立发挥生物学功能。同时，依据毕赤酵母密码子偏爱性， 将该基因片段中编码精氨酸（arg）的毕赤酵母稀有密码子（使用频率低的cgc、cga、cgg、agg）全部突变为毕赤酵母偏爱密码子（使用频率高的aga），构建出几丁质酶ao-190mut突变基因。将分子改造后的ao-190mut基因在毕赤酵母中进行高效表达，制备出可分解几丁质的高酶学活性的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut，为草食动物线虫病新型生物防控制剂的研发提供制备方法。
2、利用expasy分子生物学软件对少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190和ao-223基因及其编码蛋白序列分析，保留了几丁质酶ao-190几丁质酶保守域，同时为增加几丁质结合能力，在其n端用3段连续的柔性肽[（gggggs）3]连接几丁质酶ao-223几丁质结合结构域（xm_011129025，几丁质结合结构域cbd1和cbd2），以保证各保守域功能独立，此外，依据毕赤酵母密码子偏爱性，将毕赤酵母中编码arg使用频率极低的密码子 cgc、cga、cgg、agg突变为使用频率高的aga。将改造后的几丁质酶基因命名为 ao-190mut，经毕赤酵母偏好密码子优化，进行ao-190mut全长基因的生物合成。在此基础上，将人工改造的ao-190mut基因克隆入ppiczαa真核表达载体中，并将其转化毕赤酵母感受态细胞gs115中，用甲醇进行诱导表达。通过sds-page和western blot分析和鉴定表达产物，并用镍离子亲和层析法纯化出重组蛋白，制备出可分解几丁质的高酶学活性的少孢节丛孢菌重组几丁质酶ao-190mut。
3、本专利技术主要涉及以下几个方面的内容：少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190和ao-223基因的扩增、克隆及序列分析，少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut基因的分子改造及人工合成，少孢节丛孢菌-ao-190mut基因真核表达载体的构建与鉴定，少孢节丛孢菌几丁质酶ao本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut的制备方法，其特征在于：
2.如权利要求1所述的分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut的制备方法，其特征在于：
3.如权利要求1所述的分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut的制备方法，其特征在于：所述的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut分子改造及人工合成的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut，其特征在于根据权利要求1、2或3所述的方法制备。
【技术特征摘要】
1.一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut的制备方法，其特征在于：
2.如权利要求1所述的分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-190mut的制备方法，其特征在于：
3.如权利要求1所述的分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶ao-1...
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