【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，属于植物基因工程。
技术介绍
1、秋石斛(phalaenopsis-type dendrobium hybrids)为石斛属热带兰花，是热带地区重要观赏园艺植物之一，具有极高的产业价值。其花形若纷飞的蝴蝶，花色艳丽，种类繁多，大小多变，是花卉市场中重要的切花和盆花品种。秋石斛原产于东南亚和西太平洋岛屿，因此在泰国、新加坡等地区，产业非常发达，是当地主要的切花生产出口创汇品种。我国秋石斛产业发展较晚，产业主要分布于海南、广东、广西、云南等省区。海南省因具有得天独厚的地理优势，已发展为我国秋石斛的主产区。近年来，秋石斛盆花在海南的栽种面积逐年扩大，据统计，海南每年出货量达到500万盆以上，占广州该类花卉市场份额95％以上。
2、遗传转化是实现秋石斛分子育种的重要手段。秋石斛育种主要通过传统的杂交育种和诱变育种培育花色、花香、株型、抗逆性、抗病虫害等方面有突出表现的优良新品种，提高产品档次。自20世纪80年代首次报道植物转基因技术成功以来，该技术在作物改良应用中得到飞速发展，1988年，转基因矮牵牛的出现，标志着转基因技术开始应用于花卉育种中。相比传统育种，利用转基因技术，可以解决培育时间长、工作量大等局限性。
3、植物转基因技术是将目的基因(dna片段)分离，通过载体或直接导入植物细胞并得到表达的一种技术和方法，经典的农杆菌介导遗传转化方法和基因枪轰击转化法已应用到许多重要经济作物基础研究和应用研究中。目前为止，虽有许多兰花相关的遗传转化体系报道，但普遍存在不
4、农杆菌介导法是转基因最常用的方法之一，具有成本低、操作简单、重复性好、克隆数量少、转化片段大等独特优势。石斛兰中应用农杆菌介导法转化较晚，由于石斛兰属于单子叶植物，而单子叶植物并不是农杆菌的天然宿主，因此存在侵染不敏感现象。在石斛兰的遗传转化方面，通过农杆菌介导法，以原球茎为受体材料，成功将目的基因转入多种石斛中的文献很多，但不同石斛兰品种之间转化效率存在较大差异，本专利技术中的石斛兰品种也未见转基因研究报道。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提高秋石斛遗传转化的效率，以期为后续分子育种提供技术支持。
2、为达到上述目的，本专利技术提供了一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其包括：
3、步骤s1、获取秋石斛的球茎和幼嫩茎段作为外植体；
4、步骤s2、对所述外植体依次进行一次诱导、二次诱导和增殖，以获取生长均一的胚性愈伤组织；
5、步骤s3、利用预先获取的携带pcambia1303载体的eha105农杆菌侵染所述胚性愈伤组织；其中，所述pcambia1303载体包含gus和gfp报告基因,hpt筛选标记基因；
6、步骤s4、将侵染后的胚性愈伤组织移出所述农杆菌悬液转入共培养基进行共培养；
7、步骤s5、利用筛选培养基对共培养后的胚性愈伤组织进行抗性筛选，并筛选出由抗性胚性愈伤组织或胚状体；
8、步骤s6、将所述抗性愈伤组织或胚状体转入胚性愈伤分化培养基以分化得到转基因不定芽，
9、步骤s7、将获得的所述转基因不定芽转入生根培养基中，获得转基因小苗。
10、作为优选，步骤s2包括：
11、步骤s21、以球茎和幼嫩茎段为外植体，置于一次诱导培养基(cim1)上暗培养15-30天；获得胚性愈伤组织和嫩芽；
12、步骤s22、将一次诱导获得的嫩芽去除子叶后的茎段横切，置于二次诱导培养基(cim2)中暗培养30天获得胚性愈伤组织；
13、步骤s23、所述的胚性愈伤组织在增殖培养基中进行增殖，获得生长均一的胚性愈伤组织，增殖倍数为1.56。
14、作为优选，所述一次诱导的培养基(cim1)的配方为msd+0.2-0.5mg/l 2,4-d+0.5mg/l kt，所述二次诱导的培养基(cim2)的配方为msd+0.2-0.5mg/l 2,4-d+0.5mg/liba+0.5mg/l kt，ph5.8；msd基本培养基的配方为ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂；所述增殖培养基(p)的配方为msd+0.5mg/l iba+0.15-0.5mg/l kt，ph5.8，所述增殖培养的培养条件为暗培养。
15、作为优选，所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
16、作为优选，步骤s3中携带目的基因的所述eha105农杆菌菌体的获取方法为：取100-200μl活化后的农杆菌菌液涂在含50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yep固体培养板上，两天后获得农杆菌菌体，随后将农杆菌菌体用农杆菌重悬液重悬至od600＝0.7。
17、作为优选，所述的胚性愈伤在增殖培养基中预培养3-7天。
18、作为优选，所述农杆菌重悬液的配方为ms+30g/l蔗糖+100μmol/l as，ph 5.2。
19、作为优选，步骤s3中所述侵染的时间为抽真空负压处理20-30分钟。
20、作为优选，步骤s4中所述共培养的共培养基的配方为ms+30g/l蔗糖+8g/l琼脂粉+100μmol/l as，ph 5.2，所述共培养的培养条件为23-25℃，相对湿度70-80％条件下暗培养3天；所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
21、作为优选，步骤s5中的所述筛选培养基的配方为：p培养基+500mg/l carb+30mg/lg418或50mg/lhyg，g418为npt筛选标记基因的筛选剂，hyg为hpt基因的筛选剂；所述p培养基的配方为msd+0.5mg/liba+0.5mg/l kt，ph5.8；所述筛选的筛选周期为3-4个最小周期，每个最小周期30天，培养条件为25-28℃暗培养，直到获得抗性愈伤。
22、作为优选，步骤s6中的所述的抗性愈伤分化培养基(sf)为1/2ms+0.5mg/l iba+0.15mg/l kt+30g/l葡萄糖+8g/l琼脂+300mg/l carb+30mg/l g418或50mg/l hyg；分化条件为光照培养，光照培养的光周期12h/d，光照强度2000lx，环境相对湿度70-80％，温度25-28℃。
23、作为优选，步骤s7中的所述的抗性生根培养基为1/2ms+30g/l蔗糖+0.1-0.5mg/lnaa+8g/l琼脂，ph5.8；生根培养条件为光照培养，光照培养的光周期12h/d，光照强度2000lx，环境相对湿度70-80％，温度25-28℃。
24、相比于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
25、1、本专利技术通过农杆菌介导，将外源基因导入到秋石斛胚性愈伤，获得转基因不定芽，实现了热带兰秋石斛转基因从0到1的突破，也为后续高效遗传转本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S2包括：
3.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述一次诱导的培养基的配方为MSD+0.2-0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT，所述二次诱导的培养基的配方为MSD+0.2-0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L IBA+0.5mg/L KT，pH5.8；MSD基本培养基的配方为MS+30g/L葡萄糖+1g/L花宝1号+8g/L琼脂；所述增殖培养基的配方为MSD+0.5mg/L IBA+0.15-0.5mg/L KT，pH5.8；所述增殖培养的培养条件为暗培养，温度25-28℃，相对湿度70-80％。
4.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S3中所述携带目的基因的EHA105农杆菌菌体
6.根据权利要求5所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌重悬液的配方为MS+30g/L蔗糖+100μmol/L AS，pH 5.2。
7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S3中所述侵染的过程为抽真空负压处理20-30分钟。
8.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S4中所述共培养的共培养基的配方为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉+100μmol/L AS，pH 5.2，所述共培养的培养条件为23-25℃，相对湿度70-80％条件下暗培养3天；所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
9.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S5中的所述筛选培养基的配方为：P培养基+500mg/L Carb+30mg/L G418或50mg/L Hyg，G418为npt筛选标记基因的筛选剂，Hyg为hpt基因的筛选剂；所述P培养基的配方为MSD+0.5mg/LIBA+0.15-0.5mg/L KT，pH5.8；所述筛选的筛选周期为3-4个最小周期，每个最小周期30天，培养条件为25-28℃暗培养，直到获得抗性愈伤组织，所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
10.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤S6中的所述的抗性愈伤分化培养基为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.15mg/L KT+30g/L葡萄糖+8g/L琼脂+300mg/L Carb+30mg/L G418或50mg/L Hyg；分化条件为光照培养，光照培养的光周期12h/d，光照强度2000lx，环境相对湿度70-80％，温度25-28℃；
...【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤s2包括：
3.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述一次诱导的培养基的配方为msd+0.2-0.5mg/l 2,4-d+0.5mg/l kt，所述二次诱导的培养基的配方为msd+0.2-0.5mg/l2,4-d+0.5mg/l iba+0.5mg/l kt，ph5.8；msd基本培养基的配方为ms+30g/l葡萄糖+1g/l花宝1号+8g/l琼脂；所述增殖培养基的配方为msd+0.5mg/l iba+0.15-0.5mg/l kt，ph5.8；所述增殖培养的培养条件为暗培养，温度25-28℃，相对湿度70-80％。
4.根据权利要求2所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述暗培养条件为25-28℃，环境相对湿度70-80％。
5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，步骤s3中所述携带目的基因的eha105农杆菌菌体的获取方法为：取100-200μl活化后的农杆菌菌液涂在含50mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yep固体培养板上，两天后获得农杆菌菌体，随后将农杆菌菌体用农杆菌重悬液重悬至od600＝0.7。
6.根据权利要求5所述的一种农杆菌介导的秋石斛遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌重悬液的配方为ms+30g/l蔗糖+100μmol/l as，ph 5.2。
7.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚梅，尹俊梅，李崇晖，李志晴，蒋琼海，郭玉华，林妃，康勇，唐粉玲，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。