【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种抗bp230高亲和力单克隆抗体及其应用。
技术介绍
1、大疱性类天疱疮(bp)是一种在免疫系统攻击皮肤并引起水疱时产生的自身免疫性疾病，最常发病在60-80岁的老年人。此病特征性的临床表现为紧张性水疱和剧烈泛发的瘙痒症状。组织病理上，苏木精和曙红(he)染色可见表皮下裂隙伴随嗜酸性粒细胞浸润，直接免疫荧光(dif)可见沿基底膜带分布的线状沉积的自身抗体和/或补体，盐裂间接免疫荧光(ssiif)可见自身抗体和/或补体沉积在表皮侧。
2、患者血清中自身抗体的靶抗原是bp180和bp230，也称作bpag1和bpag2，这两种抗原的分子量分别是180kd和230kd。bp230是胞质内的半桥粒糖蛋白，主要有三种亚型：皮肤亚型(bpag1-e)，神经亚型(bpag1-n和bpag1-a)和肌肉亚型(bpag1-b)。它们在分子结构上有一定同源性，各自有组织特异性及不同的表位。大多数bp血清与bp230不同区段，尤其是c末端呈强阳性反应。bp230的n末端对其与半桥粒的结合以及与bp180、α6β4整合蛋白β4亚基的相互作用非常重要。抗bp230抗体被认为是继发性产物，可加重炎症反应。因此，检测bp患者体内抗bp230抗体水平对于辅助临床诊断具有重要意义。
3、单克隆抗体由于其高特异性和亲和力而广泛用于治疗、诊断和生物学领域。目前，大多数针对人类抗原的单克隆抗体是在小鼠体内产生的，但许多人类免疫原无法刺激小鼠产生抗体反应。相较于小鼠和大鼠等其他动物模型，兔可对更广泛的抗原产生应答
4、bp是一种常见而且顽固的获得性自身免疫性疾病，其患者血清中存在半桥粒蛋白的自身抗体，有抗bp180和bp230。bp的诊断标准包括临床表现、组织病理、直接免疫荧光、间接免疫荧光、特异性抗体检查，根据病情严重程度采用不同的治疗方案，主要依靠糖皮质激素、抗生素和免疫抑制剂等。目前糖皮质激素是公认的治疗bp的一线药物，临床疗效显著，但长期使用可引发大量并发症，有些严重的并发症甚至阻碍了临床上某些患者对该药物的使用。经典的杂交瘤技术需要耗费大量的时间和精力去获得高亲和力的抗体，而且需要进行后续的人源化改造，导致难以获得人源单克隆抗体，无法对抗体水平做到绝对定量。因此这些治疗方式缺乏特异性，疗效差且疗程长。
5、此外，在癌症患者人群开展免疫治疗也会引发bp疾病的发生。pd-1/pd-l1检查点抑制剂多用于治疗各种实体和血液系统恶性肿瘤，是一类近年来报道较多的诱发bp的药物。大部分病例在pd-1/pd-l1抑制剂开始治疗后6-8个月内出现水疱或大疱，少数病例出现黏膜受累。随着pd-1免疫治疗的普及，未来针对bp检测的需求会越来越多。但是目前如何快速准确诊断此类疾病缺乏有效检测手段，因此，提供一种检测此类疾病的方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗bp230高亲和力单克隆抗体及其应用。所述抗bp230高亲和力单克隆抗体活性高、稳定性好，且具有较强的特异性，能作为定性检测bp230阳性的参考标准，也能定量检测bp患者中抗bp230自身抗体水平。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种抗bp230高亲和力单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链cdr1的氨基酸序列如seq id no.9所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.11所示；所述单克隆抗体的轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no.12所示，cdr2的氨基酸序列为sas，cdr3的氨基酸序列如seq id no.13所示。
4、本专利技术通过免疫新西兰大白兔，对获取的pbmc进行单b细胞分选及培养。分析阳性克隆的序列后进行重组表达，获得的高亲和力的兔单克隆抗体能够定量测定bp患者中抗bp230自身抗体水平，为研究bp的致病机理奠定了实验基础，从而达到诊断或者治疗自身免疫性大疱病的目的。
5、具体地，本专利技术对实验兔进行多次bp230蛋白免疫，免疫后进行血清效价测试。分离效价高的兔子的脾脏组织和外周血的pbmc，进行单b细胞分选及培养。将阳性克隆提取rna并反转录成cdna，扩增其中全部的抗体vh、vl基因片段。将体外扩增的vh、vl基因片段克隆入含人igg恒定区的表达载体上，进行重组表达。通过elisa方法对重组抗体进行功能验证，最后从中筛选特异性好、亲和力强的人源化单克隆抗体。
6、优选地，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列包括seq id no.14，或与seqid no.14有至少80％、85％、90％或95％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
7、优选地，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列包括seq id no.16，或与seqid no.16有至少80％、85％、90％或95％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
8、优选地，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.14所示，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.16所示。
9、优选地，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列包括seq id no.15，或与seq idno.15有至少80％、85％、90％或95％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
10、优选地，所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列包括seq id no.17，或与seq idno.17有至少80％、85％、90％或95％同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
11、优选地，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如seq id no.15所示，所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如seq id no.17所示。
12、第二方面，本专利技术提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的抗bp230高亲和力单克隆抗体。
13、第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
14、第四方面，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
15、第五方面，本专利技术提供一种用于检测bp230蛋白的组合物，所述组合物包括第一方面所述的抗bp230高亲和力单克隆抗体。
16、第六方面，本专利技术提供一种用于检测样品中bp230蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的抗bp230高亲和力单克隆抗体和/或第五方面所述的用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗BP230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述单克隆抗体的轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，CDR2的氨基酸序列为SAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
3.根据权利要求1所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的权利要求5所述的表达载体，或所述宿主细胞的基因组中整合有权利要求4所述的核酸分子。
7.一种用于检测BP230蛋白的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-3中任一项所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体。
8.一种用于检测样品中BP230蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体和/或权利要求7所述的用于检测BP230蛋白的组合物。
9.权利要求1-3中任一项所述的抗BP230高亲和力单克隆抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的用于检测BP230蛋白的组合物或权利要求8所述的用于检测样品中BP230蛋白的试剂盒中任意一种或至少两种的组合在制备用于诊断大疱性类天疱疮的产品中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种抗bp230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链cdr1的氨基酸序列如seq id no.9所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.11所示；所述单克隆抗体的轻链cdr1的氨基酸序列如seq id no.12所示，cdr2的氨基酸序列为sas，cdr3的氨基酸序列如seq id no.13所示。
2.根据权利要求1所述的抗bp230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如seq id no.14所示；所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no.16所示。
3.根据权利要求1所述的抗bp230高亲和力单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如seq id no.15所示；所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如seq idno.17所示。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗bp230高亲和力单克隆...
【专利技术属性】
技术研发人员：王雅楠，杨衡，冯素英，李岷，梁桂熔，
申请(专利权)人：苏州方科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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