【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种炭疽、鼠疫和布病三重rpa检测试剂盒、引物探针组合物和应用。
技术介绍
1、炭疽杆菌（ bacillus anthracis）、鼠疫杆菌（ yersinia pestis）和布鲁氏杆菌（ brucella）可在人和动物中引起严重炭疽、鼠疫和布鲁氏菌病，严重威胁公共健康。食草动物一般在吃草时食入土壤中的炭疽芽胞而发病，通常会很快死亡，人通常是食入或接触这些病死动物被感染炭疽；鼠疫通过鼠蚤叮咬传播，传染速度快、传播性强、发病快、死亡率高；布鲁氏菌病通常是由于直接接触被感染动物、食用或饮用被污染的动物产品或吸入空气中病原体而被感染。早期发现和诊断上述三种病原体，对于疾病的扩散和控制都极为重要。
2、基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）以及实时荧光定量pcr（quantitative real-time pcr，qpcr）等的分子生物学检测方法已被广泛应用于病原菌的检测，这些方法虽然可以准确的检测病原菌，但是往往花费较长的时间，且依赖精密的仪器（如qpcr仪）与专业的生物技术人员，基本不可能实现野外现场检测。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa）作为新型核酸恒温扩增技术，最适温度在37-42℃，在10-30 min内可实现对待测靶标的快速检测，具有灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且
3、基于lfd-rpa技术，如何同时实现炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌三种病原菌的特异性、灵敏性检测，是本领域技术人员关注的热点之一。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种基于lfd-rpa的检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒、引物探针组合物和应用。
2、本专利技术还提供一种基于rpa的检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒、引物探针组合物和应用。
3、第一方面，本专利技术提供一种检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒，包括用于检测炭疽杆菌的组合物、用于检测鼠疫杆菌的组合物、用于检测布鲁氏杆菌的组合物和横向流动试纸；
4、所述用于检测炭疽杆菌的组合物包括引物lefrpa-f、引物lefrpa-r-1和探针lefrpa-probe-1；用于检测鼠疫杆菌的组合物包括引物yp01-3f、引物yp01-3r-1和探针yp01-3prboe-1；用于检测布鲁氏杆菌的组合物包括引物bscp31rpa-f、引物bscp31rpa-r-1和探针bscp31rpa-probe-1；
5、所述探针lefrpa-probe-1、探针yp01-3prboe-1和探针bscp31rpa-probe-1的结构通式如式1所示：
6、5’-x-(n)a-h-(n)b-y-3’ 式1；
7、式1中，x为第二标记基团，(n)a为第一单链dna分子，h为四氢呋喃残基，(n)b为第二单链dna分子，y为阻断基团；
8、所述引物lefrpa-f为核苷酸序列如seq id no:1所示的单链dna，所述引物lefrpa-r-1为第一标记基团修饰的核苷酸序列如seq id no:2所示的单链dna；所述探针lefrpa-probe-1中，(n)a为核苷酸序列如seq id no:3所示的单链dna分子，(n)b为核苷酸序列如seq id no:4所示的单链dna分子；
9、所述引物yp01-3f为核苷酸序列如seq id no:5所示的单链dna，所述引物yp01-3r-1为第一标记基团修饰的核苷酸序列如seq id no:6所示的单链dna；所述探针yp01-3prboe-1中，(n)a为核苷酸序列如seq id no:7所示的单链dna分子，(n)b为核苷酸序列如seq id no:8所示的单链dna分子；
10、所述引物bscp31rpa-f为核苷酸序列如seq id no:9所示的单链dna，所述引物bscp31rpa-r-1为第一标记基团修饰的核苷酸序列如seq id no:10所示的单链dna，所述探针bscp31rpa-probe-1中，(n)a为核苷酸序列如seq id no:11所示的单链dna分子，(n)b为核苷酸序列如seq id no:12所示的单链dna分子。
11、如上所述的试剂盒，引物lefrpa-f为正向引物，引物lefrpa-r-1为反向引物，且所述引物lefrpa-r-1的5’端第1位核苷酸用第一标记基团标记。
12、如上所述的试剂盒，引物yp01-3f为正向引物，引物yp01-3r-1为反向引物，且所述引物yp01-3r-1的5’端第1位核苷酸用第一标记基团标记。
13、如上所述的试剂盒，引物bscp31rpa-f为正向引物，引物bscp31rpa-r-1为反向引物，且所述引物bscp31rpa-r-1的5’端第1位核苷酸用第一标记基团标记。
14、进一步地，所述第一标记基团为生物素或荧光基团等可以被单克隆抗体识别的小分子化合物。更进一步地，引物lefrpa-r-1、yp01-3r-1、bscp31rpa-r-1的5’端第1位核苷酸均使用生物素进行标记。
15、如上所述的试剂盒，上述探针lefrpa-probe-1、探针yp01-3prboe-1和探针bscp31rpa-probe-1的结构通式如式1所示：
16、5’-x-(n)a-h-(n)b-y-3’ 式1；
17、式1中，x为第二标记基团，(n)a为第一单链dna分子，h为四氢呋喃残基，(n)b为第二单链dna分子，y为阻断基团。
18、进一步地，所述探针lefrpa-probe-1、探针yp01-3prboe-1、探针bscp31rpa-probe-1的5’端标记的第二标记基团x不同，以便与横向流动试纸检测区包被的不同抗体结合。所述探针lefrpa-probe-1、探针yp01-3prboe-1、探针bscp31rpa-probe-1的5’端标记的第二标记基团独立的选择荧光基团、地高辛等可以被单克隆抗体识别的小分子化合物。
19、进一步地，所述荧光基团选自fitc、tamra、fam、hex、cy3、cy5、rox、texas red中的一种或多种。
20、更进一步地，所述探针lefrpa-probe-1的5’端标记有荧光基团fitc；所述探针yp01-3prboe-1的5’端标记本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测炭疽杆菌的组合物、用于检测鼠疫杆菌的组合物、用于检测布鲁氏杆菌的组合物和横向流动试纸；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一标记基团为生物素。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二标记基团独立地选自FITC、TAMRA、FAM、HEX、CY3、CY5、ROX、Texas Red、地高辛中的一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断基团独立地选自C3 spacer、C6spacer、C9 spacer中的一种。
5.检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测炭疽杆菌的组合物、用于检测鼠疫杆菌的组合物和用于检测布鲁氏杆菌的组合物；
6.组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-4任一项所述的试剂盒中，用于检测炭疽杆菌的组合物、用于检测鼠疫杆菌的组合物和用于检测布鲁氏杆菌的组合物中的至少一种。
7.组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求5所述的试剂盒中，用于检测
8.权利要求1-4任一项所述的试剂盒和/或权利要求5所述的试剂盒和/或权利要求6所述的组合物和/或权利要求7所述的组合物在如下任一方面的应用：
9.检测病原菌的方法，其特征在于，包括：
10.检测病原菌的方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测炭疽杆菌的组合物、用于检测鼠疫杆菌的组合物、用于检测布鲁氏杆菌的组合物和横向流动试纸；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一标记基团为生物素。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二标记基团独立地选自fitc、tamra、fam、hex、cy3、cy5、rox、texas red、地高辛中的一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阻断基团独立地选自c3 spacer、c6spacer、c9 spacer中的一种。
5.检测炭疽杆菌、鼠疫杆菌和布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，包括用于检测炭疽杆菌的组合物...
【专利技术属性】
技术研发人员：王恒樑，吕宇飞，冯美洁，王东澍，刘先凯，朱力，潘超，郭艳，余淑娟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。