【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及帕金森病研究，具体涉及一种thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型的构建方法及应用。
技术介绍
1、帕金森氏病（parkinson’s disease, pd）是第二大常见的神经退行性疾病，主要特征为运动和非运动发生障碍，病理特征包括黒质纹状体中大量多巴胺能神经元丢失和路易小体（lewy bodies, lb）形成。α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn，基因名为snca）是lb主要成分。
2、目前，pd的动物模型包括：药物诱导的神经毒素模型（如mptp、6-ohda、鱼藤酮等）和转基因模型（如snca、parkin、lrrk2、pink1和dj-1）。mptp模型具有简单操作、可选择性地损伤多巴胺神经元的优点，可以成功复制pd特征，被用于运动障碍研究，但该模型仅能模拟pd的运动障碍，不能模拟其他非运动症状。6-ohda模型可以选择性破坏多巴胺神经元，具有较高的多巴胺神经元破坏效果，被用于运动障碍研究和药物筛选，但该模型会非特异性破坏多巴胺神经元且成活率低。rotenone（鱼藤酮）模型可以模拟线粒体功能障碍和氧化应激，故被用于线粒体功能研究，但具有操作复杂、成活率低的缺点。snca转基因模型中，修饰方式包括突变（a53t、a30p和e46k）或重复片段，其助于研究α核蛋白相关性变性、研究pd中遗传与环境因子的关系，但是部分模型无显著的多巴胺能神经元丢失、或表现出与人类pd病理不一致的细胞调亡形式。lrrk2转基因模型中，lrrk2为家族性pd致病基因，其修饰方式为突变（g2019s和r
3、thy1-snca是应用最为广泛的pd动物模型之一，其在thy1启动子下过表达人源α-突触核蛋白，表达开始于出生后第10天，10天后这种蛋白表达稳步上升，但是在不同的大脑区域之间存在一定的差异。在海马中，α-突触核蛋白表达水平从2月龄持续增加到6月龄。而纹状体α-突触核蛋白表达在2-6个月龄略有下降或保持不变，14月龄该蛋白表达下降约40%。酪氨酸羟化酶（th）水平在14月龄也有所下降，但只下降了约20%。更为重要的是，在14月龄之前thy1-snca死亡率和发病率以及一般健康状况与野生型小鼠相似，帕金森样运动障碍大约到14个月龄才表现得相对明显。
技术实现思路
1、针对现有技术中pd动物模型的不足，本专利技术旨在开发一种实验周期短、病理改变稳定的新pd动物模型。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
4、将thy1-snca小鼠与clu-ko小鼠杂交获得f1代，鉴定得到thy1-snca;clu-/+小鼠；
5、将thy1-snca;clu-/+小鼠与clu-ko小鼠回交获得f2代，鉴定得到目的基因型小鼠，即thy1-snca;clu-/-小鼠。
6、在本专利技术的构建方法中，clu-ko小鼠相对于野生型小鼠，clu基因功能丧失。
7、专利技术人发现clu可以介导α-syn降解，缓解pd症状；且将小鼠体内clu完全敲除后，可以增加体内α-syn的聚集。基于这一发现，专利技术人推测敲除clu是加快snca基因pd样症状发生的关键步骤，进而建立了thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型。实验数据表明：thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型在6月龄时就可表现出大量的酪氨酸羟化酶丢失、大量聚集的磷酸化α-syn以及步态的显著不对称性等现象，远早于thy1-snca小鼠的14月龄，从而有效缩短了实验周期。
8、优选地，在上述构建方法中，clu-ko小鼠相对于野生型小鼠缺失了如seq id no.1所示序列。clu基因位于14号染色体上且存在五个转录本，在本专利技术的一些实施例中，通过敲除外显子e3-e4区域（序列具体如seq id no.1所示，总长度为2636bp）得到clu-ko小鼠，该clu-ko小鼠与thy1-snca小鼠杂交再回交后所得thy1-snca;clu基因敲除小鼠在稳定性、病理学、行为学表征以及出现的时间点等方面均优于传统的动物模型，且动物存活率高。
9、优选地，在上述构建方法中，利用crispr/cas9系统构建clu-ko小鼠。在本专利技术的一些实施例中，clu-ko小鼠的构建方法包括以下步骤：将crispr/cas9系统和同源重组载体（donor vector）显微注射到雌性c57bl/6n背景小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，受体鼠生出f0代小鼠，提取基因组dna进行鉴定，获取clu-ko小鼠。
10、更为优选地，在crispr/cas9系统中，grna靶序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
11、更为优选地，当clu-ko小鼠缺失了如seq id no.1所示序列时，可通过序列如seqid no.4和seq id no.5所示的引物对鉴定clu-ko小鼠；且产物大小为514bp时为clu-ko小鼠，产物大小为3150bp时为野生型小鼠。
12、优选地，在上述构建方法中，鉴定thy1-snca小鼠或thy1-snca;clu-/+小鼠所用的引物包括：序列如seq id no.7-8所示的引物对和序列如9-10所示的引物对。
13、优选地，在上述构建方法中，鉴定目的基因型小鼠所用的引物包括：如seq idno.7-8所示引物对，如seq id no.9-10所示引物对，如seq id no.4所示通用引物以及如seq id no.5或seq id no.6所示反向引物。具体的，通过提取基因组dna，利用上述引物对分别进行pcr，保留同时具有thy1-snca和clu-/-基因型的小鼠即得目的基因型小鼠。
14、本专利技术第二方面提供了本专利技术构建的thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型在制备帕金森氏病模型中的应用。通过对该模型的病理及行为学检测发现，其在6月龄时就可表现出大量的酪氨酸羟化酶丢失、大量聚集的磷酸化α-syn以及步态的显著不对称性等，比thy1-snca模型更本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Thy1-SNCA;Clu基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Clu-KO小鼠相对于野生型小鼠缺失了如SEQ ID NO.1所示序列。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统敲除野生型小鼠Clu基因中如SEQ ID NO.1所示序列得到Clu-KO小鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述敲除的方法包括：将CRISPR/Cas9系统和同源重组载体显微注射到雌性C57BL/6N背景小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，受体鼠生出F0代小鼠，提取基因组DNA进行鉴定，获取Clu-KO小鼠。
5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在所述CRISPR/Cas9系统中，gRNA靶序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
6. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，鉴定所述Clu-KO小鼠所用引物的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO
7. 根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，鉴定所述Thy1-SNCA;Clu-/+小鼠所用的引物包括序列如SEQ ID NO.7-10所示引物。
8. 根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，鉴定所述目的基因型小鼠所用的引物包括序列如SEQ ID NO.4-10所示引物。
9.根据权利要求1所述构建方法构建得到的Thy1-SNCA;Clu基因敲除小鼠模型在制备帕金森氏病模型中的应用。
10.根据权利要求1所述构建方法构建得到的Thy1-SNCA;Clu基因敲除小鼠模型在研究SNCA基因的功能和作用机制中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种thy1-snca;clu基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述clu-ko小鼠相对于野生型小鼠缺失了如seq id no.1所示序列。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，利用crispr/cas9系统敲除野生型小鼠clu基因中如seq id no.1所示序列得到clu-ko小鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述敲除的方法包括：将crispr/cas9系统和同源重组载体显微注射到雌性c57bl/6n背景小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔，受体鼠生出f0代小鼠，提取基因组dna进行鉴定，获取clu-ko小鼠。
5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在所述crispr/cas9系统中，grna靶...
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