【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫诊断，尤其涉及一种重组大肠杆菌及其在检测布鲁氏菌病中的应用。
技术介绍
1、布鲁氏菌病(又称布鲁菌病，简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的一种人畜共患病，世界动物卫生组织(oie)将布病设为必须通报的动物疫病。患病的羊、牛等病畜是布病的主要传染源，布鲁氏菌可以通过破损的皮肤黏膜、消化道和呼吸道等途径传播，对畜牧业生产和人类健康造成严重的危害。及时、有效、可靠、准确的鉴定布病，在保障畜牧养殖、维护民众健康、控制布病传播等方面都至关重要。
2、布鲁氏菌是短小杆状、为兼性胞内寄生，感染动物和人后潜伏期长。血清学检测其中igg抗体是布病诊断的常用办法。常用的血清学检测方法主要是虎红平板凝集试验、试管凝集试验和酶联免疫吸附试验，这些方法均使用布鲁氏菌全菌或脂多糖(lipopolysaccharide，lps)作为抗原。
3、布鲁氏菌是二级生物安全危害病原体，全菌体或lps抗原的制备需要布鲁氏菌的大量发酵培养，需要在生物安全三级实验室完成，存在很大的生物安全风险，容易成为感染源。因此，如何更安全的制备用于布病血清学检测的抗原成为本领域技术人员关注的热点和难点。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种重组大肠杆菌，其表达并合成的多糖-蛋白偶联物可以作为布鲁氏菌病血清检测用抗原，解决目前使用布鲁氏菌生产抗原存在的生物安全的问题。
2、本专利技术还提供上述重组大肠杆菌表达得到的多糖-蛋白偶联物及其在检测布鲁氏菌病中的应用。
3、第一方面，本
4、所述蛋白质为a1)-a4)中的一种；
5、a1)氨基酸序列是seq id no:4的蛋白质；
6、a2)氨基酸序列是seq id no:4的第1-169位的蛋白质；
7、a3)将a1)或a2)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且能够与o-抗原多糖偶联的蛋白质；
8、a4)在a1)或a2)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白。
9、本专利技术中，seq id no:4的蛋白质主要由来源于化脓链球菌(streptococcuspyogenes)纤连蛋白结合蛋白(fibronectin binding protein)的cnab2结构域改造后的序列和糖基化修饰位点4573融合而成，命名为spycather-4573，简称sc4573，由177个氨基酸残基组成。seq id no:4的蛋白质中，自n端起第1位至第19位氨基酸残基为dsba信号肽序列，第20至第135位氨基酸残基为spycather(纤连蛋白结合蛋白亚单位)的氨基酸序列，第136至第140位氨基酸残基为柔性linker，第141至第169位为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白pile的第45至73位氨基酸，即4573。蛋白质sc4573主要起到糖链载体的作用；此外，spycather具有类似于“分子胶水”的功能，携带spycather的多糖-蛋白偶联物可以与携带小肽spytag的dna或者蛋白分子偶联，具有很强的拓展性。
10、脂多糖(lipopolysaccharide，lps)是菌体表面内毒素成分，光滑型s-lps主要由三部分构成：o-抗原多糖(o-antigen polysaccharide，ops)、核心多糖和类脂a。基于牛布鲁氏菌的ops表位与小肠结肠炎耶尔森菌o:9的抗原表位相似的特点，本专利技术在大肠杆菌出发菌株中合成小肠结肠炎耶尔森菌o:9的o-抗原多糖，并将偶联至上述蛋白质sc4573上，将二者的偶联物作为布鲁氏菌病血清学检测用抗原。
11、如上所述的重组大肠杆菌，小肠结肠炎耶尔森菌o:9的o-抗原多糖可根据如下方法合成得到：通过克隆参与o-抗原多糖合成的ops基因簇，并构建表达载体使其在出发菌株中进行表达，以合成o-抗原多糖。
12、进一步地，所述重组大肠杆菌含有ops基因簇，所述基因簇ops包括manc、manb、galu、galf、gmd、per、wzm、wzt、wbct、wbcu、wbcv、wbcw基因；
13、所述manc基因编码b11)-b13)中任一种蛋白质：b11)氨基酸序列是seq id no:6的蛋白质；b12)将b11)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b11)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有甘露糖-6-磷酸异构酶活性的蛋白质；b13)在b11)或b12)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
14、所述manb基因编码b21)-b23)中任一种蛋白质：b21)氨基酸序列是seq id no:7的蛋白质；b22)将b21)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b21)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有磷酸甘露糖变位酶活性的蛋白质；b23)在b21)或b22)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
15、所述galu基因编码b31)-b33)中任一种蛋白质：b31)氨基酸序列是seq id no:8的蛋白质；b32)将b31)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b31)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶活性的蛋白质；b33)在b31)或b32)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
16、所述galf基因编码b41)-b43)中任一种蛋白质：b41)氨基酸序列是seq id no:9的蛋白质；b42)将b41)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b41)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶活性的蛋白质；b43)在b41)或b42)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
17、所述gmd基因编码b51)-b53)中任一种蛋白质：b51)氨基酸序列是seq id no:10的蛋白质；b52)将b51)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b51)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有gdp-甘露糖-4,6-脱水酶活性的蛋白质；b53)在b51)或b52)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
18、所述per基因编码b61)-b63)中任一种蛋白质：b61)氨基酸序列是seq id no:11的蛋白质；b62)将b61)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b61)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有gdp-d-perosamin合成酶活性的蛋白质；b63)在b61)或b62)的n末端和/或c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
19、所述wzm基因编码b71)-b73)中任一种蛋白质：b71)氨基酸序列是s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有或合成多糖-蛋白偶联物；所述多糖-蛋白偶联物包括偶联至蛋白质上的来源于小肠结肠炎耶尔森菌O:9的O-抗原多糖；
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还含有或表达糖基转移酶。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有OPS基因簇，所述OPS基因簇包括manC、manB、galU、galF、gmd、per、wzm、wzt、wbcT、wbcU、wbcV和wbcW基因；
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌不含有或不表达O-抗原连接酶和/或与所述小肠结肠炎耶尔森菌O:9的O-抗原多糖合成存在竞争关系的蛋白。
5.多糖-蛋白偶联物，其特征在于，包括偶联至蛋白质上的来源于小肠结肠炎耶尔森菌O:9的O-抗原多糖；
6.制备权利要求5所述的多糖-蛋白偶联物的方法，其特征在于，包括：
7.权利要求1-4任一项所述的重组大肠杆菌和/或权利要求5所述的多糖-蛋白偶联物在检测布鲁氏菌病和/或制备
8.一种检测布鲁氏菌病的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的多糖-蛋白偶联物。
9.蛋白质，其特征在于，为A1)-A4)中的一种；
10.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
...【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有或合成多糖-蛋白偶联物；所述多糖-蛋白偶联物包括偶联至蛋白质上的来源于小肠结肠炎耶尔森菌o:9的o-抗原多糖；
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还含有或表达糖基转移酶。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有ops基因簇，所述ops基因簇包括manc、manb、galu、galf、gmd、per、wzm、wzt、wbct、wbcu、wbcv和wbcw基因；
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌不含有或不表达o-抗原连接酶和/或与所述小肠结肠...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕宇飞，王恒樑，张艳，朱力，王东澍，李淑磊，潘超，刘先凯，郭艳，余淑娟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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