【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒的设计及其通过rnai机制调控靶基因表达的基因抑制剂或rnai生物农药的制备。
技术介绍
1、赤拟谷盗(triboliumcastaneum)隶属于鞘翅目，拟步甲科，是我国重要的仓储害虫，主要危害面粉，还可为害玉米、稻谷、高粱、豆类、干果、中药材等。此外该害虫的分泌物含有致癌物苯醌，致使面粉发霉变质，危害人类健康。目前，国内粮库通常使用磷化氢熏蒸处理的手段进行防治。有研究报道赤拟谷盗等主要储粮害虫已对磷化氢产生抗药性，迫切需要研发新型的防治方法和策略以防治虫害。
2、rna干扰(rnai)已被广泛应用作为特异性基因沉默的强大工具。这一沉默过程由小干扰rna(sirna)介导，通常由外源的双链rna(dsrna)生成，该dsrna通过内核酸酶rnaseiii酶dicer的活性进行剪切。剪切后的sirna可以在细胞质中通过螺旋酶融化成一个正义链和一个反义链，其中正义链被切割成片段，反义链随后被装载到含多种核酸酶的rna诱导沉默复合物(risc)。risc可特异性结合到其靶向的mrna上，诱导mrna的剪切和降解，从而下调基因表达。目前，常用的sirna序列是由21-23碱基的双链rna组成的功能性核酸分子。因此，与化学农药相较，该方法具有专一性强、绿色安全等优势。其作用机理是外源双链rna(double-stranded rna，dsrna)可被昆虫dicer酶所识别，并剪切为小干扰rna(smallinterference rna，sirna)，在rna沉默复合体(rna-
3、目前研究表明，赤拟谷盗对rnai较敏感，基于rnai的害虫防治具有极大的应用价值。尽管rnai在基因治疗和病虫害防治等领域引起了关注，但sirna在生物体内的直接递送和靶基因沉默仍然存在诸多挑战。首先，裸露的sirna携带负电荷(约为-35mv)、结构刚性较强且具有亲水性，不容易穿透细胞膜。此外，裸露的sirna在生物学上不稳定，具有相对较低的空间电荷密度，难以形成紧凑的sirna颗粒。因此，不稳定、松散的sirna分子容易受到生物体中核酸酶的攻击，在到达目标位点之前即被迅速降解，从而导致sirna活性不足，无法有效降解目标mrna。
4、解决这些难点的方法包括将sirna与递送系统结合(如阳离子载体)以及对寡核苷酸进行直接化学修饰。然而，传统的纳米递送系统，如脂质体和聚合物系统，在大小、组成和表面化学方面不均匀，这可能导致干扰效率低、缺乏组织特异性和潜在毒性等问题。使用阳离子物质，通过静电电荷相互作用将sirna包载制成致密纳米粒子，虽然在体外可有效被细胞摄取并发挥rna干扰活性，但可能导致潜在免疫反应、毒性和制剂的不一致性。另一方面，尽管化学修饰可以提高sirna的效力和稳定性，但依然存在潜在的毒性效应，以及损害sirna的活性。
5、因此，开发一种安全、简单、生物相容的载体系统至关重要，该系统最好是采用天然未修改的寡核苷酸，能够有效地将sirna以活性形式传递到目标位点。核酸分子具有空间可编程性，可被设计成具有特定纳米结构的载体分子，这使得基于dna或rna的纳米结构在sirna递送方面具有重要的应用潜能。由于核酸的柔韧性和可变形性，核酸纳米颗粒可以轻松地编程成精确的形状和大小，用于搭载sirna分子。比起单链或双链rna，核酸纳米颗粒具备更优的内吞作用，以实现更高的细胞摄取效率。同时，rna纳米粒子被认为具有橡胶般的特性，有助于它们穿透血管并增强增强渗透和滞留(epr)效应。与基于聚合物或脂质的纳米递送载体不同，基于核酸的纳米载体可以被生物体内的核酸酶降解，从而避免传递载体的毒性。因此，采用dna和rna纳米技术制备的核酸纳米组装体有望成为sirna的新型递送载体。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种可有助于提高害虫防治效率的含小干扰rna的核酸纳米颗粒、制备方法及其应用，用于解决现有sirna存在干扰效率低、缺乏组织特异性和潜在毒性的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述核酸纳米颗粒是将靶向目标基因的多个sirna整合到具有3～5个折叠单位的rna支架上形成一条单链rna分子，该单链rna分子经自我折叠后形成结构稳定的rna纳米颗粒(简称为sarn)，所述rna纳米颗粒为sarn3w、sarn5w、sarn3w-2x和sarn5wt中的任意一种。
3、优选的，所述sirna为含21个核苷酸的双链rna，为sirna-1、sirna-2、sirna3、sirna-4、sirna-5中的任意一种，其中：
4、sirna-1的正义链的核苷酸序列如seq id no.5所示，sirna-1的反义链的核苷酸序列如seq id no.6所示：
5、正义链(5’-3’)：5’-gcaaccaccatctagccaagt-3’
6、反义链(5’-3’)：5’-acttggctagatggtggttgc-3’；
7、sirna-2的正义链的核苷酸序列如seq id no.7所示，sirna-1的反义链的核苷酸序列如seq id no.8所示：
8、正义链(5’-3’)：5’-gcggtgtatcaatgcaaatac-3’
9、反义链(5’-3’)：5’-gtatttgcattgatacaccgc-3’；
10、sirna-3的正义链的核苷酸序列如seq id no.9所示，sirna-1的反义链的核苷酸序列如seq id no.10所示：
11、正义链(5’-3’)：5’-gcgagatagacatgtatatga-3’
12、反义链(5’-3’)：5’-tcatatacatgtctatctcgc-3’；
13、sirna-4的正义链的核苷酸序列如seq id no.11所示，sirna-1的反义链的核苷酸序列如seq id no.12所示：
14、正义链(5’-3’)：5’-ggacgtcatcaaggttgaacc-3’
15、反义链(5’-3’)：5’-ggttcaaccttgatgacgtcc-3’；
16、sirna-5的正义链的核苷酸序列如seq id no.13所示，sirna-1的反义链的核苷酸序列如seq id no.14所示：
17、正义链(5’-3’)：5’-gcttcgcagttgtcagattcg-3’
18、反义链(5’-3’)：5’-cgaatctgacaactgcgaagc-3’。
19、在本申请的rna纳米颗粒中，sarn本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述核酸纳米颗粒是将靶向目标基因的多个siRNA整合到具有3～5个折叠单位的RNA支架上形成一条单链RNA分子，该单链RNA分子经自我折叠后形成结构稳定的RNA纳米颗粒；所述RNA纳米颗粒为SARN3w、SARN5w、SARN3w-2x和SARN5wt中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述siRNA为含21个核苷酸的双链RNA，所述siRNA为含21个核苷酸的双链RNA，为siRNA-1、siRNA-2、siRNA3、siRNA-4、siRNA-5中的任意一种，其中：
3.根据权利要求1所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒，其特征在于：SARN3w的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；SARN5w的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；SARN3w-2x的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；SARN5wt的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述靶向目标基因
5.根据权利要求1所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述siRNA的个数为≥3。
6.一种如权利要求1～5中任一项所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3还包括将siRNA整合进具有3～5个折叠单位的RNA支架上后，在每个siRNA臂的末端基于互补配对加入90°-kink结构。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3还包括将siRNA整合进具有3～5个折叠单位的RNA支架上后，在每个siRNA臂的末端基于互补配对加入tRNA-scaffold结构。
9.一种如权利要求1～5中任一项所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒或如权利要求6～8中任一项所述的制备方法制备的核酸纳米颗粒在制备SARN核酸递送系统中的应用。
10.一种如权利要求1～5中任一项所述的一种含小干扰RNA的核酸纳米颗粒或如权利要求6～8中任一项所述的制备方法制备的核酸纳米颗粒在制备防治赤拟谷盗药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述核酸纳米颗粒是将靶向目标基因的多个sirna整合到具有3～5个折叠单位的rna支架上形成一条单链rna分子，该单链rna分子经自我折叠后形成结构稳定的rna纳米颗粒；所述rna纳米颗粒为sarn3w、sarn5w、sarn3w-2x和sarn5wt中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述sirna为含21个核苷酸的双链rna，所述sirna为含21个核苷酸的双链rna，为sirna-1、sirna-2、sirna3、sirna-4、sirna-5中的任意一种，其中：
3.根据权利要求1所述的一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒，其特征在于：sarn3w的核苷酸序列如seq id no.1所示；sarn5w的核苷酸序列如seq id no.2所示；sarn3w-2x的核苷酸序列如seq id no.3所示；sarn5wt的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.根据权利要求1所述的一种含小干扰rna的核酸纳米颗粒，其特征在于：所述靶向目标基因为赤...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。