基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基于线粒体ＤＮＡ拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的ＮＤ１引物混合液，Ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ引物混合液，ＰＣＲ反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照ＤＮＡ，其特征是，ＮＤ１引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：Ｆ：５’－ＡＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡ－３’和５’－ＡＡＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴ－３’；所述的Ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：Ｆ：５’－ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴ－３’和Ｒ：５’－ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧ－３’。本发明专利技术能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测用的试剂盒，具体涉及基于线粒体DM拷贝数预测高原肺 水胂发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水肿的易感性。
技术介绍
高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,缩写HAPE)是一种特发于高 原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短 的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的 急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族 人群中，高原肺水肿的发病率高达O. 4%-2%。高原肺水肿发病有明显的家族和个 体易感倾向，环境因素和遗传貝素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗 传因素在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视张雪峰，高原施工人群 急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005; 15(3): 7-8;陈有，高 原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高钰琪， 高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。由于线粒体是动物细胞内唯一含有DNA和蛋白质合成系统的细胞器，是氧 传送链的生理终点站，是细胞氧耗的主要位点。它在低氧习服和适应中发挥着 重要作用。高原肺水肿是一种低氧习服不良的急性高原病，因而线粒体在高原 肺水肺的发生中发生着重要的作用Moudgi 1 R， Hypoxic pulmonary vasoconstriction,《J Appl Physiol》，2005; 98: 390-403。线丰立体呼吸链氧化磷酸化不但与线粒体DNA结构的完整性相关，还与其拷贝数相关，线粒 体DNA拷贝数增加被认为是总线粒体呼吸功能的代偿，目前已经发现许多疾病 的易感性与线粒体DNA拷贝数相关周云丽，乳腺癌线粒DNA拷贝数改变的研 究及意义，《天津医科大学学报》，2005; 11 (5): 525-527;许洪波，喉癌线粒体 DNA拷贝数的临床意义，《中国耳鼻咽喉头颈外科》，2006， 13 ( 4 ): 219-222。 关于线粒体DNA拷贝数与高原肺水肿易感的相关性尚无报道。通过SYBR (即SYBR GREEN染料，缩写SYBR )定量PCR(聚合酶链反应)的 方法检测线粒体DNA拷贝数，发现线粒体DNA拷贝数与高原肺水肿易感性之间 存在相关性。具体^L法是(1 )健康对照组标本(25例)在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml (EDTA 抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一周内没有发生高原肺水肿；(2)高原肺水肿病例組标本(25例)为与健康对照组标本年龄匹配，按 高原病诊断标准我国高原病命名、分型及诊断标准，《高原医学杂志》，19%: 2-4符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循赫尔辛基宣言， 本研究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml (EDTA抗凝)。(3 )分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组 抽提试剂盒(货号SK1342 )提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本的血 液白细胞DNA,然后釆用定量PCR(SYBR染料法)的方法分别扩增健康对照组标 本和高原肺水肿病例组标本的线粒体DNA上的ND1基因(NADH Dehydrogenase Subunitl,缩写ND1 )和核基因编码的看家基因Beta-actin;再分别计算每例 标本的NDl拷贝数与Beta-actin的拷贝数的比值，结果经SPSS 12.0 (—种统计软件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0. 05为相差显著，并通过该软件 计算出95%的可信区间，以分別得到健康对照组和高原肺水肿病例组 NDl/Beta-actin拷贝数的参考值，结果发现在高原肺水肿病例组中 舰/Beta-actin的拷贝数比值显著降低(表1 )。表l高原肺水肿病例组和健康对照组中NDl/Beta-actin拷贝数比值健康对照组(n=25)高原肺水肿病例组(n=25)NDl/Beta-actin0. 0822±0. 00940. 0291±0. 0055495%可信区间0. 0625-0. 10200. 0176-0. 0407高原肺水肿病例组vs健康对照组P=0. 000
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试 剂盒，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿 的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁。 —本专利技术所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒， 包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌 去离子水，定值标准品，健康对照13M，其特征是，所述的ND1引物混合液中的上游引物(F)和下游引物U)的序列为 F: 5， -ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3，和R: 5， -AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3，； 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGMGGCTGGAAGAGTG-3，； 所述的PCR反应液,含有PCR緩冲液、MgCl2、 dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、SYBR 染料、Ex Taq酶;6所述的定值标准品是用Beta-act in的上下游引物在PTC-200 PCR仪中进行 目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆栽体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌 液中提取质粒。所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml (EDTA抗凝)，并且到 高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA，再将DNA 浓度调为50ng/y 1。所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的ND1引物混合液为lOOpl;其中上游引物和下游引物各50jal，浓度均为 10pmo1/)J 1。所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的Beta-actin引物混合液为400 nl;其中上游引物和下游引物各200 p 1，浓 度均为lOomol/ p 1。所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200 yl，浓度分别为 1X104、 1X105、 1X106、 1X107、 1X1。8拷贝/jn 1。所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的无菌去离子水为1500ja 1。本专利技术建立了利用定量PCR (SYBR染料法)方法检测来线粒体DM拷贝数 的方法，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水 肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。 具体实施例方式本专利技术所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于线粒体ＤＮＡ拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的ＮＤ１引物混合液，Ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ引物混合液，ＰＣＲ反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照ＤＮＡ，其特征是，　所述的ＮＤ１引物混合液中的上游引物和下游引物的序 列为：　Ｆ：５’－ＡＴＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＣＣＣＡ－３’和Ｒ：５’－ＡＡＴＡＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＴ－３’；　所述的Ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为：　Ｆ：５’－ＣＧＧＧ ＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴ－３’和Ｒ：５’－ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧ－３’；　所述的ＰＣＲ反应液，含有ＰＣＲ缓冲液、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、ＳＹＢＲ染料、Ｅｘ　Ｔａｑ酶；　所述的定值标准品是用Ｂｅｔａ－ａｃ ｔｉｎ的上下游引物在ＰＴＣ－２００ＰＣＲ仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的ＰＣＲ产物，然后将目的片段插入克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ基因片段的菌液中提取质粒。

【技术特征摘要】
1、基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的ND1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。2、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽，陈有，高文祥，高钰琪，黄大愿，黄学文，刘福玉，罗勇军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]