【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因组编辑，具体地涉及crispr/cas系统的新鉴定的两种核酸内切酶gs12-4、gs12-12及其应用。
技术介绍
1、jennifer doudna和emmanuelle charpentier两位教授最早将crispr/cas系统用于基因编辑，并于2020年获得了诺贝尔化学，由此，crispr/cas系统受到科学家们的广泛关注，crispr/cas基因编辑技术快速崛起。目前，crispr系统分为两大类，第一大类包括ⅰ型、ⅲ型和ⅳ型，第二大类包括ⅱ型、ⅴ型和ⅵ型。不同crispr/cas基因编辑系统的组成、作用机制有区别。第一类crispr/cas系统是由多个cas效应蛋白组成，其效应蛋白是cas3、cas8和cas10组成的复合体，其中，cas3是i型系统中的核心，与第一类crispr/cas系统相比，第二类crispr/cas系统只有单一效应蛋白。crispr/cas系统依赖crrna引导，定位到pam或pfs序列，和特异性目的片段结合，激活cas核酸酶切割靶核酸。
2、在cas9之后几年发现的cas12a是一种源自第2大类v型crispr/cas系统的cas核酸酶，同样能够用于基因组编辑。与cas9相比，cas12a长度略短于cas9，不需要tracrrna来激活，通过crrna与目标dna片段配对就可以实现基因编辑。cas12a蛋白具有反式切割活性，其作用机理如下：检测体系中的cas12a与相应的crrna结合为cas12a-crrna复合体，该复合体识别靶标dna的pam位点，随之dna
3、crispr/cas12a系统以其独特优势使得基因编辑领域取得了划时代的发展。比如，cas12a蛋白介导的核酸检测具有易操作、便携、耗时短、高灵敏性、高特异性等诸多优势；cas12a蛋白介导的基因治疗具有较高的基因敲除效率，且crrna较短，便于递送，更适合用于疾病治疗。但仍存在一些薄弱环节，cas12a潜伏的脱靶效应不可忽视，目前的研究阶段无法完全应用于临床治疗。需要进一步挖掘cas蛋白，能够让该技术不断成熟，能够进行安全、有效的应用。
技术实现思路
1、本专利技术首次开发了crispr/cas系统的新型核酸内切酶gs12-4、gs12-12及其介导的基因编辑系统，本专利技术还建立了基于gs12-4、gs12-12核酸酶介导的核酸可视化检测技术。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、crispr/cas系统中的核酸内切酶，包括以下蛋白：
4、ⅰ、seq id no.1所示氨基酸序列的gs12-4核酸酶；seq id no.2所示氨基酸序列的gs12-12核酸酶；
5、ⅱ、与seq id no.1或seq id no.2所示的氨基酸序列相比，具有80％以上的序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；
6、iii、与seq id no.1或seq id no.2所示的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。
7、融合蛋白，包含上述核酸内切酶，以及与所述蛋白的n端或c端连接的多肽。
8、多核苷酸，所述多核苷酸为编码上述核酸内切酶的多核苷酸，或编码上述融合蛋白的多核苷酸。
9、含有所述多核苷酸的载体。
10、一种可视化核酸检测试剂盒，包括上述的核酸内切酶，单链dna荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导rna。
11、一种crispr/cas基因编辑系统，包括上述的核酸内切酶，或上述的融合蛋白，或上述的多核苷酸，或上述的载体，还包括能够结合所述的核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
12、本专利技术的技术方案具有如下主要的有益效果：
13、1.本专利技术首次提供了一种结合宏基因组学与实验手段挖掘到的新型crispr/cas12a系统家族新成员gs12-4、gs12-12。
14、2.本专利技术发现核酸内切酶gs12-4、gs12-12与已知cas12a核酸酶(pam为tttv)相比，其优点在于具有覆盖靶标位点范围更广的基因组编辑能力。
15、3.本专利技术首次提供了crispr/gs12-19系统介导的核酸可视化检测技术。
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1.CRISPR/Cas系统中的核酸内切酶，其特征在于，包括以下蛋白：
2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。
3.分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶的多核苷酸，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体。
6.根据权利要求5所述的CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，还包括能够结合权利要求1所述的核酸内切酶的同向重复序列和能够靶向目标序列的引导序列。
7.权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体在核酸检测中的应用。
8.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，单链DNA荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导R
...【技术特征摘要】
1.crispr/cas系统中的核酸内切酶，其特征在于，包括以下蛋白：
2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。
3.分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶的多核苷酸，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。
4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种crispr/cas基因编辑系统，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李新云，杨洁，谢胜松，赵书红，陶大刚，李晟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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