【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种真菌酸性多糖偶联物的制备方法。
技术介绍
1、侵袭性念珠菌病很难在感染早期建立诊断，因为其发病隐匿，进展迅速，临床症状和影像学不够典型和特异，培养的敏感性很低，缺乏安全有效的抗真菌治疗手段，疾病死亡率高，故早期、快速、正确地鉴定出念珠菌感染，对目标治疗具有重要的临床意义。改进及时诊断的技术主要集中在检测真菌释放的循环替代标记物上。随着基于非培养的方法的发展，如pcr和抗原检测，可以在侵袭性疾病患者感染的早期阶段检测到循环标记物。念珠菌感染的典型原因是白色念珠菌（约43.63%），其次是近平滑念珠菌（约40.85%）、光滑念珠菌（约6.86%）、热带念珠菌（约5.56%）及其他念珠菌（约3.1%）。
2、甘露聚糖（mn）是念珠菌细胞壁的主要成分之一，占其干重的7%，当念珠菌感染时甘露聚糖会释放入血，是感染期间循环的主要念珠菌抗原之一。mn试验是侵袭性念珠菌病的早期诊断方法，已被国内外专家共识及指南推荐。侵袭性念珠菌病的临床诊断方法主要包括影像学检查、组织病理学检查、培养及镜检、mn试验和分子生物学检测方法。念珠菌igg抗体检测对于对侵袭性念珠菌病（ic）、念珠菌血症及慢性播散性念珠菌病有辅助诊疗意义（非粒细胞缺乏患者），其与mn联合检测，可提高诊断灵敏度，降低漏检率，可用于疾病的治疗检测和区分感染与定植。
3、既往研究从念珠菌培养菌体中提取甘露聚糖，工艺复杂、产量较低且特异性差。目前，本领域迫切需要开发一种简便、高效、低成本、特异性高的念珠菌甘露聚糖偶联物的制备方法，并能够有
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种真菌酸性多糖偶联物的制备方法，得到的甘露聚糖偶联物抗原纯度高，且制备方法简便、高效、成本低，并能够有效的避免使用有毒有害的化学试剂，同时原理简单，操作时间短，条件易掌控，便于批量生产，可获得高纯度的甘露聚糖抗原，非常有利于作为抗体生产过程的免疫原及检测抗体的包被材料。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了甘露聚糖抗原偶联物的制备方法，包括：将经过dmp氧化的甘露聚糖与bsa偶联，获得所述甘露聚糖抗原偶联物。
4、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述氧化的方法包括：将dmp与吡啶混合，再与甘露聚糖混合，室温反应20 min、25 min、30 min、35 min或40 min，用碳酸氢钠溶液洗去副产物，得到所述经过dmp氧化的甘露聚糖。
5、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述dmp与所述吡啶的质量体积比为0.01 g/5 μl。
6、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述dmp与所述甘露聚糖的质量比为1:20。
7、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述偶联的方法包括：加热所述经过dmp氧化的甘露聚糖到熔点以上的温度，完成偶联；
8、所述熔点以上的温度可以是140℃、145℃、150℃、155℃、160℃、165℃或170℃。
9、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述加热的时间为15 min、20min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min、1 h、2 h、3 h或4 h。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法所述甘露聚糖为甘露聚糖纯品，所述甘露聚糖纯品的制备方法包括以下步骤：
11、步骤（a1）：将富含甘露聚糖的菌液进行抽滤、醇沉、离心、干燥，获得甘露聚糖粗提物；
12、步骤（a2）：采用十六烷基三甲基溴化铵使所述甘露聚糖粗提物中的蛋白和核酸沉淀以去除所述蛋白和所述核酸，再使所述十六烷基三甲基溴化铵与甘露聚糖络合，获得的络合物用酸溶解再醇沉，获得甘露聚糖沉淀；
13、步骤（a3）：将所述甘露聚糖沉淀进行酶解以去除多余的杂糖和蛋白，将得到的酶解产物通过阴离子交换层析柱，获得所述甘露聚糖纯品。
14、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法中所述菌液在抽滤前还包括灭活的步骤。
15、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a1）所述的菌液为具有甘露聚糖的菌株的培养液；
16、所述菌株包括真菌；
17、所述真菌包括念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌、青霉菌中的至少一种。
18、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a1）所述醇沉包括采用甲醇或乙醇醇沉。
19、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a2）所述十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.05 g/ml。
20、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a2）所述十六烷基三甲基溴化铵可以以甲酰胺、菲林试剂中的至少一种替代。
21、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a2）所述络合通过与酸混合再将ph调节至碱性实现络合。
22、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a2）所述用酸溶解包括用乙酸溶解。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a2）所述醇沉包括用体积为4倍的乙醇进行醇沉。
24、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a3）所述酶解包括采用淀粉酶、葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶、β-葡萄糖苷酶中的至少一种酶解。
25、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述制备方法的步骤（a3）所述阴离子交换层析柱包括deae-cellulose阴离子交换层析柱、cona琼脂糖凝胶4b亲和层析柱或葡聚糖凝胶层析柱。
26、本专利技术的制备方法有如下效果：
27、1. 使用本专利技术方法得到的甘露聚糖抗原偶联物纯度更高，消除了杂糖、蛋白及其它杂质的干扰；
28、2. 甘露聚糖抗原偶联物分子量分布均一、尺寸均匀，消除了粗提物中杂糖的干扰；
29、3. 本专利技术采用菌液上清提取甘露聚糖，并对其纯化制备得到的甘露聚糖抗原原材料来源广泛、操作简单、成本低、产量高、特异性佳，且具有优良的免疫活性。
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1.甘露聚糖抗原偶联物的制备方法，其特征在于，将经过DMP氧化的甘露聚糖与BSA偶联，获得所述甘露聚糖抗原偶联物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘露聚糖为甘露聚糖纯品，所述甘露聚糖纯品的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（A1）所述的菌液为具有甘露聚糖的菌株的培养液；
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（A1）所述醇沉包括采用乙醇醇沉。
5.如权利要求2至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（A2）所述十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.05 g/mL。
6.如权利要求2至5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（A2）所述络合通过与酸混合再将pH调节至9.5实现络合。
7.如权利要求2至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（A2）所述用酸溶解包括用乙酸溶解。
8.如权利要求2至7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（A2）所述醇沉包括用体积为4倍的乙醇进行醇沉。
9.如权利要求2至8任一项所述的制备方法
10.如权利要求2至9任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（A3）所述阴离子交换层析柱包括DEAE-Cellulose阴离子交换层析柱。
...【技术特征摘要】
1.甘露聚糖抗原偶联物的制备方法，其特征在于，将经过dmp氧化的甘露聚糖与bsa偶联，获得所述甘露聚糖抗原偶联物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘露聚糖为甘露聚糖纯品，所述甘露聚糖纯品的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（a1）所述的菌液为具有甘露聚糖的菌株的培养液；
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（a1）所述醇沉包括采用乙醇醇沉。
5.如权利要求2至4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（a2）所述十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.05 g/ml。
6.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：王新明，崔珍珍，吴文娟，李博，刘功成，吴学炜，付光宇，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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