【技术实现步骤摘要】
本专利技术实施例涉及抗原检测，具体为一种快速原位杂交检测方法及其应用。
技术介绍
1、现有的hpv探针(原位杂交)检测试剂盒和eber探针(原位杂交)检测试剂盒采用荧光原位杂交技术，使用标记有地高辛的hpv探针(eber探针)与组织细胞中的特异性靶序列杂交结合，地高辛抗体与hpv探针(eber探针)反应形成免疫复合物，同时使用增强型二抗试剂与地高辛抗体-hpv探针(eber探针)复合物结合，最后hrp催化dab在结合位点形成棕黄色沉淀，从而在显微镜下显示出细胞中的特定靶rna序列位点。该方法采用荧光原位杂交技术，使用了增强型二抗进行信号放大，方法耗时较长，且特异性较低，而本专利技术中快速原位杂交方法涉及的抗体不需要采用增强型二抗，直接使用抗体和ap的复合物检测dna-rna杂合体，最后催化底物发光，这种抗体具有很强的dna-rna杂合体的结合能力，该抗体的使用，缩短了反应时间，提高了检测的灵敏度及特异性。
2、s9.6小鼠单克隆抗体是在1986年用噬菌体φx174免疫的小鼠中产生的，这是一种基因组长dna-rna杂交。所得到的s9.6对dna-rna杂交体具有高亲和力和特异性，同时对双链rna(dsrna)具有低亲和力，对单链dna(ssdna)或单链rna(ssrna)没有亲和力。因为其独特的特性，s9.6免疫球蛋白提供了许多应用程序的基础包括溶液识别dna-rna杂交体，未检测的转录活性基因组区域，体外和体内识别r环(单链基因组dna退火新生mrna)转录细胞，和无标记mirna(一类由内源基因编码的长度约为22
3、虽然现有技术中的s9.6小鼠单克隆抗体对dna-rna杂交体相比于市面上的抗体具有更高的特异性和灵敏度，但其在进行elisa检测时仍然会存在非特异性识别造成背景值很高，因此筛选一株低背景值的抗dna-rna杂交体抗体对病毒的检验及对肿瘤细胞的检测具有非常重要的意义。鉴于此，我们提出一种快速原位杂交检测方法及其应用。
技术实现思路
1、本专利技术实施例的目的在于提供一种快速原位杂交检测方法及其应用，该一种快速原位杂交检测方法及其应用，解决了现有技术中在进行elisa检测时仍然会存在非特异性识别造成背景值很高的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：
3、一种快速原位杂交检测方法及其应用，包括以下步骤，
4、s1、抗dna-rna杂合体抗体的制备；抗dna-rna杂合体抗体为抗dna-rna杂合体小鼠单克隆抗体，可以特异性识别任一dna-rna杂合体发生抗原-抗体免疫反应；所述用于编码步骤s1中抗dna-rna杂合体小鼠单克隆抗体的重链编码基因为seqid1，
5、caggtgcagctgcagcagagcggcccggaactggtgaaaccgggcgcgagcgtgaaaatgagctgc
6、aaagcgagcggctatacctttaccagcctgcgcattaccgattgggtgaaacagaaaccgggccag
7、ggcctggaatggattggcgatgtgagcagcaaaaaagaactggataaaagccaggaaaaagaagaa
8、gtgcagaccaaagcgaccctgaccagcgataaaagcagcagcaccgcgtatatggaactgagcagc
9、ctgaccagcaaagatagcgcggtgtattattgcgcgcgccagcataaaagcgaagaagatattctggcgtggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagc；
10、轻链编码基因为seqid2，
11、gatattgtgatgacccagaccccgctgagcctgccggtgagcctgggcgatcaggcgagcattagc
12、tgcaacatttgccgcaactgccagtgcctgagctgcatggattgcggcaaagatttttggtatctg
13、cagaaaccgggccagagcccgaaactgctgatttatagcgaagatcagaaatatggcggcaaagat
14、ggcgtgccggatcgctttagcggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtg
15、gaagcggaagatctgggcgtgtattattgcggcaaagaaagcctggaaaacgaatttgaaattttt
16、ggcggcggcaccaaactggaaattaaacgcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc；
17、所述的抗dna-rna杂合体抗体的重链氨基酸序列为seqid3，qvqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftslritdwvkqkpgqglewigdvsskkeldksqekee vqtkatltsdkssstaymelssltskdsavyycarqhkseedilawgqgttltvss；
18、轻链氨基酸序列为seqid4，
19、divmtqtplslpvslgdqasiscnicrncqclscmdcgkdfwylqkpgqspklliysedqkyggkd
20、gvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycgkeslenefeifgggtkleikrggggsggggsggggsggggs。
21、所述步骤s1中的抗dna-rna杂合体抗体的制备包括以下步骤，
22、s1.1、免疫动物；以100μg/ml dna-rna杂合体和100μg/ml甲基化的牛血清白蛋白按质量比1:1在10mm te缓冲液中进行混合，按每只balb/c小鼠30μg dna-rna杂合体的量与弗氏完全佐剂乳化，腹部皮下注射，第14天和第28天分别加强免疫(采用同初次免疫同样的剂量和弗氏不完全佐剂乳化)一次，第35天，经小鼠尾巴取血进行检测；
23、s1.2、制备杂交瘤细胞系；取免疫小鼠淋巴细胞经细胞融合、克隆筛选，获得可高效分泌抗体的阳性杂交瘤稳定细胞株，从杂交瘤细胞系中分离出总rna；
24、s1.3、获得抗体序列；将总rna逆转录成cdna，利用特异性的引物，通过pcr扩增技术获得抗体重链可变区和抗体轻链可变区的核苷酸序列；
25、s1.4、抗体表达和纯化；将所述核苷酸序列克隆至表达载体中，使用转染方法瞬时转染培养的细胞，培养后收集上清，使用protein a纯化上清液，得到纯度>95％的抗体；
26、s2、快速原位杂交检测；
【技术保护点】
1.一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S1中的抗DNA-RNA杂合体抗体为抗DNA-RNA杂合体小鼠单克隆抗体，可以特异性识别任一DNA-RNA杂合体。
3.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述用于编码步骤S1中抗DNA-RNA杂合体小鼠单克隆抗体的重链和轻链编码基因序列分别为SEQID1和SEQID2；所述用于编码步骤S1中抗DNA-RNA杂合体小鼠单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别为SEQID3和SEQID4。
4.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2中的快速原位杂交检测包括以下检测步骤，
5.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2.1中所述的脱蜡液主要组分为二甲苯，需将切片依次在三罐二甲苯溶液中浸泡5min。
6.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2.2中所述的阻水笔为油性笔，用于锁住后续滴加的缓冲液
7.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2.3的EBER探针，为EB病毒特异性靶点互补的DNA序列，该序列为保护序列，其长度为35bp；
8.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2.4中的抗体经过Protien G柱纯化，抗体稀释液稀释1000倍后使用，所述的抗体稀释液组分为，氯化钠2.535-3.501g；Tris-HC1缓冲液6-7ml；酪蛋白溶液20-28ml；防腐剂28-31μl；余量为纯水；Tris-HCl的pH值为7.4-7.5；
9.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤S2.5中的DAB显色液需现配现用，配置至使用时间不应超过1h；
10.一种快速原位杂交检测应用，其特征在于：包括如权利要求1-9任一一项所述的一种快速原位杂交检测方法在抗DNA-RNA杂合体抗体蛋白分子检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤s1中的抗dna-rna杂合体抗体为抗dna-rna杂合体小鼠单克隆抗体，可以特异性识别任一dna-rna杂合体。
3.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述用于编码步骤s1中抗dna-rna杂合体小鼠单克隆抗体的重链和轻链编码基因序列分别为seqid1和seqid2；所述用于编码步骤s1中抗dna-rna杂合体小鼠单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列分别为seqid3和seqid4。
4.根据权利要求1所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤s2中的快速原位杂交检测包括以下检测步骤，
5.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于：所述步骤s2.1中所述的脱蜡液主要组分为二甲苯，需将切片依次在三罐二甲苯溶液中浸泡5min。
6.根据权利要求4所述的一种快速原位杂交检测方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：林丽琴，邱粤，薛霞铭，毛朝，汪鹏，胡杰锋，
申请(专利权)人：杭州百殷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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