【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因表达与调控，具体为一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法。
技术介绍
1、猪胚胎附植和胎盘发育异常导致的妊娠损失高达20％，同时也是体细胞克隆胚胎死亡的主要因素，但关键调控机制尚不清楚。
2、合胞素基因(syncytin)是胎盘发育的关键调控基因，由内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus，ervs)的env基因进化而来。本方案分析了猪基因组中的env基因，并利用bulk转录组测序分析了正常和scnt胚胎与胎盘之间表达差异，筛选到候选合胞素基因。同时，通过系统发育分析鉴定候选合胞素基因的进化特征。并通过细胞融合与假型病毒试验鉴定猪合胞素基因典型功能特征。本方案首次在猪基因组中发现猪关键合胞素基因，揭示猪合胞素基因介导猪合子基因组激活与胎盘促融合与介导病毒进入功能，为解决妊娠失败和体细胞克隆效率低的问题提供新的理论依据；
3、由于猪原代胚胎滋养层细胞系的缺乏，如若通过表达和敲除或者缺失进一步验证内源性猪合胞素基因的功能则面临一定的困难与挑战，ervs的env基因进化形成的合胞素基因是调控哺乳动物胎盘滋养层细胞分化和胎盘形态多样性的关键基因，因此，只有鉴定出猪关键合胞素基因，并揭示其调控胎盘滋养层细胞分化的机制，才能解决正常胚胎和体细胞克隆胚胎附植期妊娠损失率较高的问题。
4、因此，本专利技术提供一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法以解决上述提出的问题。
技术实现思路
1、(一)解决的技术问题
2、
3、(二)技术方案
4、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，包括以下步骤：
5、步骤一：生物信息学鉴定；
6、步骤二：胚胎收集与培养；
7、步骤三：猪胎儿成纤维细胞分离培养与冻存；
8、步骤四：体外受精胚胎制备；
9、步骤五：核移植胚胎制备；
10、步骤六：反转录pcr；
11、步骤七：荧光定量pcr；
12、步骤八：pcr扩增；
13、步骤九：细胞融合试验；
14、步骤十：假型病毒试验。
15、优选的，所述生物信息学鉴定的具体步骤为：
16、1)、在ncbi的geo数据库收集猪组织与胚胎转录组测序数据，使用fastq-dumpv2.9.6将sra对象转换为fastq文件，利用hisat2v2.2.1将gcf_000003025.6猪参考基因组建立基因组索引，然后将fastq文件比对至参考基因组得到原始bam文件，并通过samtoolsv1.17将bam文件排序从而进行下一步tpm(transcriptsperkilobasemillion)与counts值计算；
17、2)、在ncbi的genome数据库中下载gcf_000003025.6猪参考基因组fasta文件，利用tblastnv2.5.0将参考基因组fatsa文件建立核苷酸数据库；
18、ncbi蛋白库中accensionnumber为np_041188.1、yp_004222726.1、np_045939.1、np_056899.1、np_054717.1、np_040334.1、np_057856.1、np_056883.1、np_043923.1作为tblastn程序中的query，参数默认，将第一次tblastn得到的hits通过氨基酸大于或等于70aa且无终止密码子进行迭代tblastn，将迭代tblastn得到的hits通过氨基酸大于或等于70aa且无终止密码子并去冗余后得到149个有价值hits，将149条hits根据染色体号以及起始终止位置与方向制作成基因组注释文件，并加入至gcf_000003025.6参考基因组注释文件并重新排序用于转录组数据计算与分析；
19、3)、使用stringtie2v2.2.1计算以上149条hits的tpm与counts，通过设置参数“-rf”明确规定bam文件的转录本组装的链特异性，将得到的gtf文件通过stringtie2中“-merge”参数合并从而得到一个合并后的gtf文件，使用stringtie2的“-e、-rf”参数计算收集的组织与胚胎的样品的tpm与counts，发现149条hits中有2条hits与合并后得到的组装转录本重叠，因此将其命名为sus1(loc100624077)与sus2，并且发现sus1在早期胚胎中4-cell与8-cell表达且表达量较高，其他组织中广泛表达，sus2仅在胎盘与肺中表达，且胎盘中高表达；
20、4)、使用ncbi的conserveddomian数据库发现sus1与sus2都具有保守结构域tlvcoatsuperfamily和ebola_hiv-1-like_hr1-hr2superfamily，且都具cxxc与rxxr基序，利用signalp6.0，参数默认，发现sus2具信号肽结构域。
21、优选的，所述胚胎收集与培养的具体步骤为：
22、1)、从屠宰场收集的卵巢放入含1×青链霉素生理盐水的保温瓶，水温为20℃，4h内运抵实验室；
23、2)、剪去卵巢外多余的组织，用生理盐水反复洗涤干净，然后用带12号针头的注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，将抽取的卵泡液注入60mm培养皿，在体视显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体(cocs)，移入采卵用pbs；
24、3)、多次洗涤后，选择颗粒细胞包裹致密且卵胞质黑亮均匀的cocs，放入提前预热的卵母细胞体外成熟培养液(om)；每3ml om最多容纳100个cocs；
25、4)、在38.5℃，5％co2的细胞培养箱中培养20-22h，成熟完毕后，在om中用吸头轻微吹打cocs至颗粒细胞仅剩3-4层，这样的cocs可用于制备ivf胚胎，吹打至大部分卵子不再黏附颗粒细胞；
26、5)、再移入颗粒细胞消化液，38.5℃消化3min，最后移入新的om中，用玻璃吸头拨动卵子，挑取排出第一极体的卵子，用于制备孤雌与核移植胚胎。
27、优选的，所述猪胎儿成纤维细胞分离培养与冻存的具体步骤为：
28、1)、猪胎儿成纤维细胞采用组织块贴壁法分离，即收集一月龄纯种长白猪胎儿，浸入含5×青链霉素双抗的pbs三次，每次3min，用眼科剪和镊子剥离胎猪皮肤组织，浸入bffs培养液，剪碎为0.5-1.0mm3的组织块；
29、2)、再将组织块均匀贴附于60mm细胞培养皿，倒置放入37℃，5％co2的细胞培养箱，10min后，向组织块滴加新鲜培养液，正置放入培养箱；
30、3)、4h后向培养皿补加4mlbffs培养液，培养3-4d后，观察猪胎儿成纤维细胞的迁出情况，并更换新鲜的培养液，继续培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述生物信息学鉴定的具体步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述胚胎收集与培养的具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述猪胎儿成纤维细胞分离培养与冻存的具体步骤为：
5.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述体外受精胚胎制备的具体步骤为：
6.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述核移植胚胎制备的具体步骤为：
7.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述反转录PCR的具体步骤为：
8.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述细胞融合试验的具体步骤为：
【技术特征摘要】
1.一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述生物信息学鉴定的具体步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述胚胎收集与培养的具体步骤为：
4.根据权利要求1所述的一种筛选与鉴定猪胚胎附植关键基因的方法，其特征在于，所述猪胎儿成纤维细胞分离培养与冻存的具体步骤为：
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，刘雅怡，张媛媛，李卉佳，张涌，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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