【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及新的嵌合质粒文库的构建方法。
技术介绍
1、随着合成生物学的发展，连接多个基因而成的长链dna的需求逐渐增加。在长链dna的序列设计中，必然需要研究所使用的基因的种类的选项、该基因的表达强度的选项等大量的表达参数，因此，通过单次序列设计就能实现目标结果的可能性较低。于是，在多数情况下，实施dbtl循环(设计、构建、测试和学习的循环，design-build-test-learn cycle)成为了前提，所述dbtl循环是首先进行设计(design)，对构建(build)而得的长链dna进行评价(test)，针对其内容进行研究(learn)，并基于其发现而构建新的dna。为了在该dbtl循环中同时研究大量的表达参数，从各表达参数存在的多个选项中选择1个并将其分别连接而构建多种长链dna的组合文库技术从效率性的观点考虑是理想的。即，较之仅构建并评价单一的长链dna，同时并行地构建并比较各表达参数中具有多样性的多种长链dna的方式更容易以较短的循环得出针对各表达参数的dna设计的方向性。
2、然而，长链dna的合成通常耗费金钱成本、时间成本，往往难以构建多条长链dna。在长链dna构建中，出于通过化学合成能够供应的dna的长度较短(200个碱基左右)等理由，使用的是通过大量准备以基因的功能单位等为指标的短dna片段，并将它们连接(组装)进行构建的多基因片段组装技术。作为这样的dna片段的组装方法，研发了ogab法(专利文献1：日本特开2004-129654号公报，非专利文献1：tsuge,k.等，nuclei
3、为了以低成本简单地供应多种长链dna，可以考虑同时准备表达参数不同的多个短dna片段以用于上述基因组装，制作将其组合地连接的组合文库。在上述基因组装方法中，也研发了构建组合文库的方法。
4、此外，在评价(test)通过上述方法供应的长链dna的组合文库，并研究(learn)表达参数的设计方向性时，需要将长链dna的基因型与其表型对应。以往的组合文库的构建中大致存在2种方法。第1种是在1个基因组装中构建1种长链dna的方法。在此情况下，按对应于组合文库的规模的数量个别实施材料各自不同的基因组装。其优点在于，由于可以提前掌握哪种基因组装会成为哪种基因型，因而即使在test中不重新确认基因型也能迅速取得与表型的对应，但缺点在于难以大规模化。第2种是将组合文库中所用的所有材料混合，通过1次基因组装来构建文库的方法。该方法具有易于获得大规模的组合文库的优点。然而，其问题在于，对于通过该文库选出的克隆具有哪一种基因型，需要通过个别地测序来确认碱基序列，长链dna越长则碱基序列的确认越耗费时间，因此test成为了限速步骤。
5、现有技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：日本特开2004-129654号公报(专利第4479199号)
8、非专利文献
9、非专利文献1：tsuge,k.等，nucleic acids res.31，e133，2003
10、非专利文献2:li mz,elledge sj,nature methods 4：251-256,2007
11、非专利文献3:engler,c.等，plos one,2008
12、非专利文献4:gibson,d.g.等，nat.methods,6,343-345.,2009
13、非专利文献5:de kok,s.等，acs synth.biol.,2014
14、非专利文献6:gibson,d.g.等，proc.nat.acad.sci.usa 6,105,20404-20409,2008
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、在上述情况下，本专利技术以提供新型的微生物细胞转化用dna片段的制备方法为课题，所述方法能够高效地构建长链dna的组合文库，且即使不实施做为限速步骤的碱基序列确认也能迅速准备用于下一轮dbtl循环的长链dna的组合文库。
3、用于解决课题的手段
4、为了高效地实施长链dna的组合文库构建，如上所述使用多基因片段组装技术是优选的，但不论是何种基因组装技术，做为组装对象的基因片段不会过量或不足的状态、即各基因片段的摩尔浓度相等都是重要的。然而，由于难以将大量(特别是多于10个的)基因片段的摩尔浓度调整至相等的摩尔浓度，因此难以利用基因组装技术高效率地构建包含大量选项的组合文库。
5、通常，成为用于实施基因组装的材料的基因片段的准备需要按片段逐个实施，并且，将这些片段以等摩尔浓度进行合并时，虽然会测定dna的重量浓度，基于dna片段的长度进行计算以决定添加量，但由于dna浓度的测定误差、dna的移液误差等，准确地进行等摩尔合并是极其困难的。另一方面，将单次组装而成为质粒状态的组装体通过限制性内切酶切割后还原为原始材料的情况下，得到的材料成为理想的等摩尔状态。本申请的专利技术人发现，实际上，使用上述材料再次实施组装时，组装效率较之通过上述以人手合并dna片段进行组装的情况提高100倍以上(tsuge,nar,2003)。并且，以限制性内切酶切割后分解为选项片段的组装体的情况下，即使该选项片段的碱基序列未被鉴定，只要实物dna是存在的，就可以通过将其与同样地准备的来源于其它组装体的选项片段混合来构建组合文库。本申请的专利技术人得到上述结果的启发，完成了本专利技术的高效的长链dna组合文库构建方法。
6、即，本申请的专利技术人为了解决上述课题进行深入研究，结果在利用枯草芽孢杆菌的质粒转化系统的基因组装方法(ogab法)中，为了使用于组合文库的组装的所有dna片段的摩尔浓度的比率尽可能接近1，采用了上述方法。具体而言，构建了将成为组合化对象的选项基因片段连接在一起而得的种子质粒(seed plasmid)。然后，对于其它的选项基因片段，另外构建种子质粒，从而准备数量等于选项的最大数量的种子质粒。通过以限制性内切酶切割各种子质粒，得到将基因片段等摩尔混合而成的溶液。该溶液即使与其它种子质粒混合，等摩尔性也得以维持。然后，通过将上述溶液所含的各种基因片段连接为直线状，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其中，所述微生物细胞转化用DNA片段具有至少1个插入DNA单元，所述插入DNA单元包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的DNA、和单位DNA连接而成的插入DNA，所述制备方法的特征在于包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其特征在于，通过步骤(B)得到的单位DNA混合液中的、所有的DNA片段的摩尔浓度的比率为0.8～1.2。
3.如权利要求1或2所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，1种插入DNA单元所含的单位DNA的种类为3～60种。
4.如权利要求1至3中任一项所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其中，步骤(B)中使用的限制性内切酶为3种以下。
5.如权利要求1至4中任一项所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其中，所述限制性内切酶为生成突出末端的限制性内切酶。
6.质粒，其含有通过权利要求1至5中任一项所述的制备方法得到的微生物细胞转化用DNA片段。
7.微生物细胞转化用DNA片
8.如权利要求7所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法，其特征在于，选择多种含有得到的长链DNA片段的质粒，作为步骤(B’)中的质粒进行再利用。
9.嵌合质粒文库的构建方法，其使用权利要求1至5、7、8中任一项所述的微生物细胞转化用DNA片段的制备方法。
...【技术特征摘要】
1.微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，所述微生物细胞转化用dna片段具有至少1个插入dna单元，所述插入dna单元包含含有在宿主微生物中有效的复制起点的dna、和单位dna连接而成的插入dna，所述制备方法的特征在于包括下述步骤：
2.如权利要求1所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其特征在于，通过步骤(b)得到的单位dna混合液中的、所有的dna片段的摩尔浓度的比率为0.8～1.2。
3.如权利要求1或2所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，1种插入dna单元所含的单位dna的种类为3～60种。
4.如权利要求1至3中任一项所述的微生物细胞转化用dna片段的制备方法，其中，步骤(b)中使用的限制性内切酶为3种以下。
5.如权利要求1至4中...
【专利技术属性】
技术研发人员：柘植谦尔，石井纯，近藤昭彦，
申请(专利权)人：国立大学法人神户大学，
类型：发明
国别省市：
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