【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及原代细胞培养，具体涉及一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法。
技术介绍
1、原代小胶质细胞的分离培养是生物医药领域中重要的环节，为多种神经系统疾病研究提供了十分重要的细胞模型。目前分离培养原代小胶质细胞有取自大脑组织或皮层。相比小胶质细胞系，原代小胶质细胞在形态和生理功能上都能更好地模拟动物体内细胞，提供更为准确的生物学信息。
2、目前大量研究者在原代小胶质细胞分离培养时方法各种各样，动物选择、操作步骤、细胞接种密度、培养基选择等等都不尽相同。如有的研究者选用新生24或48小时以内的幼鼠，解剖分离获得全脑组织后细分皮层或者直接使用全脑组织，经胰酶消化后制备单细胞悬液并将混合细胞接种培养板，期间不断换液并通过摇床振荡方法或拍打法进一步纯化获得小胶质细胞。根据国内外报道的各种分离培养方案进行摸索，均不能得到理想的原代小胶质细胞，且通过摇床长时间振荡方法或拍打法纯化小胶质细胞的方案可行性低，细胞得率低、状态差。
3、目前大部分研究者都是单独分离培养原代小胶质细胞(48小时内的新生幼鼠)和原代神经元(孕16-19天雌鼠)。这一方面增加小鼠用量，不能很好地体现动物伦理3r原则；另一方面也占据更多实验时间并增加人员工作量。此外，先前研究者在获得混合细胞后通过不断换液来分离培养胶质细胞，并在后期纯化步骤中通过摇床振荡若干小时或拍打法获得小胶质细胞。在实际操作中发现这类方法可行性低，小胶质细胞很难脱落、细胞得率很低，且长时间在室温振荡也极大降低小胶质细胞活性。
4、本专利技术通过前期稳定
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，采用前期维持培养+后期0.0625％胰酶短暂消化法，方便、快捷获得高活力、高纯度和增殖快的小胶质细胞。
2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：
3、一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，包括以下步骤：
4、s1：胎鼠脑组织解剖，将预处理后的胚胎转入提前预冷的高糖dmem培养基；
5、s2：将步骤s1所得胎鼠分离获得皮层组织制备皮层单细胞悬液；将皮层组织剪碎，静止沉淀后弃上清并加入0.125％胰酶吹打混匀后转入一次性平皿并置于培养箱消化10min，期间取出平皿摇晃1次；加入等量完全培养基终止消化，轻柔吹打后将组织及上清转入15ml离心管，静止沉淀后吸取上清于新离心管，组织沉淀再次加入0.125％胰酶重复消化1-2次并收集全部细胞上清；所有细胞上清经40μm筛网过滤制备单细胞悬液后再转入新15ml离心管，800rpm/min离心3min后弃上清，加入分离培养基重悬细胞沉淀后转入提前用多聚赖氨酸包被过的t25培养瓶于培养箱培养；
6、s3：基于步骤s2所得皮层单细胞悬液培养皮层原代小胶质细胞，向t25培养瓶中每隔2-3天补充3ml的新鲜维持培养基，培养至第10天，小胶质细胞呈现贴壁状态，倒置显微镜下可观察到细胞分层明显(底层为扁平而宽大、多触角且形态多样的星形胶质细胞，小胶质细胞则附于上层呈现圆形且形态偏小、折光性强)。弃上清，加入2-3ml的0.0625％胰酶，轻轻晃动培养瓶并随时观察小胶质细胞消化情况。待上层小胶质细胞消化脱落后，立即将消化液转移至15ml离心管并加维持培养基终止消化；视小胶质细胞情况再重复消化1-2次，收集全部小胶质细胞悬液，800rpm/min离心3min，弃上清加维持培养基重悬小胶质细胞；将小胶质细胞悬液以30万/孔的密度铺于提前包被爬片的6孔板，培养30分钟后弃上清再添加维持培养基继续培养；
7、经典小胶质细胞培养方案存在步骤繁琐、细胞产量和纯度低等问题，本技术方案采用低浓度胰酶从混合胶质细胞中获得小胶质细胞，这样既不损伤细胞的活性，又可以更好的将细胞消化成单细胞状态，减少了细胞成团现象，再将获得的小胶质细胞悬液铺板于包被过的6孔板，并于30分钟后进行全换液，目的是为了除去未贴壁的杂细胞，得到纯度更高的小胶质细胞。另外，整个培养过程中不需要额外添加生长因子就能保证小胶质细胞较好的功能状态和活力。
8、s4：对步骤s3所得皮层小胶质细胞进行纯度鉴定，计算小胶质细胞纯度。
9、进一步的，所述步骤s1具体包括：孕鼠颈椎脱臼处死后迅速置于75％酒精中浸泡5min，而后转入超净工作台固定孕鼠，无菌剪刀剪开腹部取出充满胚胎的子宫放入提前预冷的1*pbs平皿中。平皿用封口膜密封后转入细胞间生物安全柜；
10、提前在生物安全柜内准备好预冷1*pbs以及含2％双抗1*pbs，将子宫依次放入pbs清洗表面并做消毒，再转入提前预冷的高糖dmem培养基；用无菌小剪刀和镊子撕开子宫，剥离胚胎、胎膜和胎盘，并将胚胎转入提前预冷的高糖dmem培养基；全程将所有平皿置于冰上进行操作。
11、进一步的，所述步骤s2中分离获得皮层组织具体包括：左手持弯镊插入胎鼠两眼处以适当力度固定，右手持小剪刀依次剔除皮肤、骨骼并分离取出完整的脑组织；从嗅球位置剥离脑膜并剔除含血管组织，用弯镊沿中间轻轻分开左右大脑半球，用弯镊轻轻分离夹取皮层，转入预冷的高糖dmem培养基，全程将所有平皿置于冰上进行操作。
12、进一步的，所述维持培养基包括90％dmem-f12培养基与10％胎牛血清。
13、进一步的，所述分离培养基包括89％dmem-f12培养基、10％胎牛血清与1％青/链霉素。
14、进一步的，所述步骤s4具体包括：纯化培养2天后检测小胶质细胞纯度，通过免疫荧光手段检测小胶质细胞中iba1表达并计算小胶质细胞纯度；
15、计算小胶质细胞纯度包括：4％多聚甲醛固定爬片小胶质细胞，经tritonx-100破膜、脱脂奶粉封闭后，iba1一抗4度孵育过夜，荧光二抗常温(15-25℃)孵育2小时后，含dapi防淬灭封片剂封片后于荧光显微镜下观察荧光信号并拍摄，计算小胶质细胞纯度。
16、另一方面，本专利技术提出上述方法在建立神经系统疾病体外细胞培养模型中的应用。
17、本专利技术的有益效果：
18、本专利技术显著提高了小胶质细胞的纯度和活力，纯化的小胶质细胞状态好，重新铺板后30分钟即可贴壁，纯化2天后检测纯度可达98％以上，细胞基本呈圆形、大小均一、折光性强；本专利技术采用0.0625％低浓度胰酶进行短暂消化替代传统的高浓度胰酶或长时间摇床振荡。低浓度胰酶可以在保证细胞消化效果的同时，减少对细胞的机械损伤。胰酶消化过程中随时观察小胶质细胞的消化状态，避免过度消化，这种实时监控确保了细胞活力。在消化完成后，立即用完全培养基终止消化，迅速转移细胞，降低了胰酶对细胞的潜在损害。有效减少了细胞膜结构的破坏，保持了细胞的完整性和功能性，因此得到了状态良好、折光性强的小胶质细胞。
19、本专利技术有效降低了实验过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：孕鼠颈椎脱臼处死后迅速置于75％酒精中浸泡5min，而后转入超净工作台固定孕鼠，无菌剪刀剪开腹部取出充满胚胎的子宫放入提前预冷的1*PBS平皿中；平皿用封口膜密封后转入细胞间生物安全柜；
3.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述步骤S2中分离获得皮层组织具体包括：左手持弯镊插入胎鼠两眼处固定，右手持小剪刀依次剔除皮肤、骨骼并分离取出完整的脑组织；从嗅球位置剥离脑膜并剔除含血管组织，用弯镊沿中间分开左右大脑半球，用弯镊分离夹取皮层，转入预冷的高糖DMEM培养基，全程将所有平皿置于冰上进行操作。
4.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述维持培养基包括90％DMEM-F12培养基与10％胎牛血清。
5.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述分离培养基
6.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述步骤S4具体包括：纯化培养2天后检测小胶质细胞纯度，通过免疫荧光手段检测小胶质细胞中Iba1表达并计算小胶质细胞纯度；
7.如权利要求1-6任一项所述方法在建立神经系统疾病体外细胞培养模型中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括：孕鼠颈椎脱臼处死后迅速置于75％酒精中浸泡5min，而后转入超净工作台固定孕鼠，无菌剪刀剪开腹部取出充满胚胎的子宫放入提前预冷的1*pbs平皿中；平皿用封口膜密封后转入细胞间生物安全柜；
3.如权利要求1所述的简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于：所述步骤s2中分离获得皮层组织具体包括：左手持弯镊插入胎鼠两眼处固定，右手持小剪刀依次剔除皮肤、骨骼并分离取出完整的脑组织；从嗅球位置剥离脑膜并剔除含血管组织，用弯镊沿中间分开左右大脑半球，用弯镊分离夹取皮层，转入预冷...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐莉萍，徐宜润，徐天瑞，柏蓉，蒋德云，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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