【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有2.5～8.75(v/v)％的丙二醇(以下可称为“pg”)的哺乳动物细胞冷冻保存液(以下可称为“本冷冻保存液”)，以及包括将包含哺乳动物细胞的本冷冻保存液冷冻保存的步骤(a)的哺乳动物细胞冷冻保存方法(以下可称为“本冷冻保存方法”)等。
技术介绍
1、细胞的冷冻保存作为细胞生物学研究中必不可少的技术被广泛应用。近年来，细胞冷冻保存技术不仅被应用于世界各地细胞库中各种确立细胞株的保存，还被应用于畜牧业中物种的保存，用于家畜增产的精子、卵子或受精卵的冷冻保存，以及生殖医疗中生殖细胞的冷冻保存等。
2、胚胎干细胞(embryonic stem cell；es细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell；ips细胞)等多能干细胞是具有无限增殖能力和向多种组织细胞多分化能力的细胞。对于人类多能干细胞，期望利用其特性应用于再生医疗，为实现这一目标，必须确立高质量的细胞冷冻技术，即在解冻后保障较高的细胞存活率和未分化性的细胞冷冻技术。
3、细胞的冷冻保存方法一般可大体划分为缓慢冷冻法和快速冷冻法(玻璃化法)。缓慢冷冻法是使细胞悬浮在包含甘油、二甲基亚砜(以下有时称为“dmso”)、水解角蛋白、水解明胶、血清、血清白蛋白等作为冷冻保护剂的冷冻保存液(专利文献1～5)中，以每分钟约1℃的速度降温而逐渐进行冷冻的方法。通过缓慢地冷却，将细胞内的水分子用冷冻保护剂置换而脱水，抑制细胞内和细胞周围的冰晶的生长，防止细胞膜和细胞内结构的损伤以及蛋白质的变性和断裂(非专利文献1)
4、另一方面，玻璃化法是为了抑制因冷冻导致的细胞内外的冰晶生成而通过快速冷却使其以玻璃状冷冻的方法。玻璃化法从1937年被报道直至被实用化的技术开发经历了较长的期间，于1985年开发出了使用含有由高浓度dmso、乙酰胺、pg和聚乙二醇(以下称为“peg”)构成的冷冻保护剂的玻璃化保存液的方法。通过这种方法的开发，实现了小鼠早期胚胎的冷冻保存，以及用缓慢冷冻法难以实现的牛胚和猪胚的冷冻保存。目前，包括胚胎库在内的许多机构都在使用玻璃化法。
5、最近，正在积极进行人es细胞和ips细胞的冷冻保存液的开发以及冷冻保存方法的改进。例如，有报道称，如果使人es细胞悬浮在含有5％dmso、10％胎牛血清(fetalbovine serum；fbs)和10％乙二醇(eg)的冷冻保存液中，使用简单缓慢冷冻法进行冷冻保存，则解冻后的细胞存活率会提高(非专利文献2)。还有报道称，如果使人es细胞或ips细胞悬浮在冷冻保存液(stem－cellbanker[日本全药工业社制])中，使用简单缓慢冷冻法进行冷冻保存，解冻后的细胞存活率会提高(非专利文献3)。
6、此外，还提出了含有海藻糖等糖类和pg，且不含dmso、增稠剂和天然动物源性成分的细胞冷冻保存用溶液(专利文献6)。此外，还提出了含有从由牛磺酸、甘氨酸及其衍生物构成的集合中选择的至少一种，以及除dmso外的冷冻保护剂、水溶性多糖类和寡糖类的动物细胞冷冻保存液(专利文献7)。
7、[现有技术文献]
8、[专利文献]
9、[专利文献1]国际公开第2003/064634号小册子
10、[专利文献2]日本特开平6－46840号公报
11、[专利文献3]日本特开平7－255469号公报
12、[专利文献4]日本特开平8－325101号公报
13、[专利文献5]日本特开2002－233356号公报
14、[专利文献6]国际公开第2019/172112号小册子
15、[专利文献7]日本特开2021－000027号公报
16、[非专利文献]
17、[非专利文献1]j.r.dobrinsky，theriogenology，45，17－26(1996)
18、[非专利文献2]y.s.ha et al.，human reprod.，20，1779－1785(2005)
19、[非专利文献3]f.holm et al.，human reprod.，25，1271－1279(2010)
技术实现思路
1、[专利技术要解决的问题]
2、本专利技术的目的是提供一种能够有效抑制哺乳动物细胞的因冷冻融解发生的细胞死亡，并且能够有效提高冷冻融解后的哺乳动物细胞的增殖能力的细胞冷冻保存液，以及使用该细胞冷冻保存液的哺乳动物细胞冷冻保存方法。
3、[问题解决的手段]
4、本专利技术人在为解决上述问题而反复进行的深入研究中发现，如果将哺乳动物细胞冷冻保存在含有2.5～5％的pg的细胞冷冻保存液中，则与冷冻保存在含有2.5～5％的dmso的细胞冷冻保存液中的情况相比，冷冻融解后的哺乳动物细胞的增殖能力更高(例如，后述实施例的图1～图3)。此外还确认了，如果将哺乳动物细胞冷冻保存在含有2.5～5％的pg的细胞冷冻保存液中，则与冷冻保存在含有2.5～5％以外浓度的pg的细胞冷冻保存液中的情况相比，能够更有效地提高冷冻融解后哺乳动物细胞的增殖能力(例如，后述实施例的图4和图8)。进一步还确认了，如果将哺乳动物细胞冷冻保存在含有2.5～8.75％的pg的细胞冷冻保存液中，则与冷冻保存在含有2.5％～8.75％以外浓度的pg的细胞冷冻保存液中的情况相比，能够更有效地抑制哺乳动物细胞的通过冷冻融解发生的细胞死亡(例如，后述实施例的图7)。本专利技术是基于这些认识而完成的。
5、也就是说，本专利技术如下所述。
6、〔1〕一种哺乳动物细胞冷冻保存液，包含2.5～8.75(v/v)％丙二醇。
7、〔2〕如上述〔1〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，丙二醇的浓度为2.5～5.0(v/v)％；被用于提高冷冻融解后哺乳动物细胞的增殖能力。
8、〔3〕如上述〔1〕或〔2〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，还包含从右旋糖酐或其衍生物或者它们的盐、以及羟乙基淀粉或其衍生物或者它们的盐中选择的高分子化合物。
9、〔4〕如上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，还包含海藻糖或其衍生物或者它们的盐。
10、〔5〕如上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，为包含2.5～8.75(v/v)％丙二醇的等渗液。
11、〔6〕如上述〔5〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，等渗液选自乳酸林格氏液、生理盐水、林格氏液和乙酸林格氏液。
12、〔7〕如上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，哺乳动物细胞为间充质干细胞、t细胞或造血干细胞。
13、〔8〕如上述〔1〕～〔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，包含2.5～8.75(v/v)％的丙二醇。
2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，丙二醇的浓度为2.5～5.0(v/v)％；被用于提高冷冻融解后哺乳动物细胞的增殖能力。
3.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，还包含从右旋糖酐或其衍生物或者它们的盐、以及羟乙基淀粉或其衍生物或者它们的盐中选择的高分子化合物。
4.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，还包含海藻糖或其衍生物或者它们的盐。
5.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，为包含2.5～8.75(v/v)％丙二醇的等渗液。
6.如权利要求5所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，等渗液选自乳酸林格氏液、生理盐水、林格氏液和乙酸林格氏液。
7.如权利要求1～6中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为间充质干细胞、T细胞或造血干细胞。
8.如权利要求1～6中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，包含
9.如权利要求8所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为间充质干细胞、T细胞或造血干细胞。
10.如权利要求9所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，包含脐带血。
11.一种哺乳动物细胞冷冻保存方法，其特征在于，包括将权利要求8所述的哺乳动物细胞冷冻保存液冷冻保存的步骤(a)。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(a)之后、将哺乳动物细胞冷冻融解并培养5天以上的步骤(b)。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，包含2.5～8.75(v/v)％的丙二醇。
2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，丙二醇的浓度为2.5～5.0(v/v)％；被用于提高冷冻融解后哺乳动物细胞的增殖能力。
3.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，还包含从右旋糖酐或其衍生物或者它们的盐、以及羟乙基淀粉或其衍生物或者它们的盐中选择的高分子化合物。
4.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，还包含海藻糖或其衍生物或者它们的盐。
5.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，为包含2.5～8.75(v/v)％丙二醇的等渗液。
6.如权利要求5所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，等渗液选自乳酸林格氏液...
【专利技术属性】
技术研发人员：西村益浩，小森奈月，
申请(专利权)人：株式会社大塚制药工场，
类型：发明
国别省市：
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