【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器及其应用。
技术介绍
1、电化学生物传感器属于新兴的电化学生物电子学学科，这是一个涉及生物学、化学、材料、医学以及纳米技术、微电子学、信息技术和其他多个学科技术的跨学科领域。电化学生物传感器是借助电化学活性传感器原件-电极，分析由生物组成成分或生物受体产生的电活性物质，并且可以将产生的电活性物质直接转换为电子信号进行检测的一种分析方法，具有快速、灵敏、操作简便等特点，已广泛应用于检验的各个方面。然而常规电化学生物传感器导电性差、电荷转移电阻大、检测精确低，因此需要设计一个导电性强，电荷转移电阻小，检测精确度高的电化学生物传感器。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器及其应用，通过在ito玻璃电极上放置此复合膜作为工作电极，实现经典三电极体系，进行检测应用的一种新技术。
2、本专利技术的技术方案具体如下：基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤；（1）多孔膜的预处理；首先，在直线加速器上，用能量为单个重离子辐照聚合物，得到具有离子径迹的薄膜，然后用紫外光照射对其进行敏化；（2）多孔膜的制备；将聚合物膜包埋在电导池的两个腔间，一个腔内填充蚀刻液，另一个腔内填充停止液，然后在膜上施加电压，刻蚀过程停止在一个所需的电流值对应于一定的尖端直径，得到含有多个纳米孔道的薄膜；（3）纳米粒子修饰
3、进一步的，所述步骤（1）中，聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜、聚碳酸酯（pc）膜或聚酰亚胺（pi）膜，纳米孔道的形状为锥状，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5 µm，孔密度为1×103~1×1015个/cm2，紫外光的波长300~400 nm，照射时间为2小时。
4、进一步的，所述步骤（2）中，化学刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6 mol/l~9 mol/l，阻止液为1 mol/l~3 mol/l的氯化钾和1 mol/l~3 mol/l的甲酸，施加电压为1v，在30℃条件下进行，所需电流值对应尖端直径根据dtip=4li/πk(c)ud来计算，其中l为孔长；i是电流；u为施加电压；dtip和d分别为尖端直径和基部直径；k (c)是电解质的比电导率，对于25℃下的1 mol/l~3 mol/l的氯化钾溶液，其k (c)为0.11173 ω-1cm-1。
5、进一步的，所述步骤（3）中，纳米粒子为直径10~20 nm的金纳米粒子，浸泡时间为10分钟。工作电极为ito导电玻璃衬底，铂丝为对电极，ag/agcl为参比电极，电化学工作站为chi660e，电解质溶液为4 mol/l~6 mol/l的金属氧化物溶液，通过恒温器将沉积浴温度保持在30℃。
6、进一步的，所述步骤（4）中，edc的浓度为10 mg/l~20 mg/l，nhs的浓度为3 mg/l~5mg/l，探针dna水溶液浓度为2 µm/l~5 µm/l，ph 7.0~8.0，探针反应时间为12小时，在室温下进行。
7、进一步的，所述步骤（5）中，bsa水溶液浓度为8 mg/ml~10 mg/ml，ph 7.0~8.0，浸泡时间为1小时，在室温下进行。
8、本专利技术还涉及一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器及其应用，其特征在于，具体检测过程如下：（1）所有电化学测试均在三电极池中进行，将纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器置于ito导电玻璃上制成工作电极，将对电极和参比电极与工作电极一起置于电解池中，在电解池中加入电解质溶液，频率设为10-2~105hz，交流振幅为3 mv~5 mv，使用电化学工作站进行电化学阻抗测试；（2） 将修饰过探针的复合膜置于ito导电玻璃上制成工作电极进行电化学阻抗测试，获得孵育前的阻抗响应；（3）将目标物标准样品作为孵育液加入电化学生物传感器的cdna功能化的纳米孔道中，在35℃~40℃条件下孵育100~120分钟后，将孵育液吸出，用去离子水清洗，加入电解质溶液，频率和交流振幅和之前均一致，进行电化学阻抗测试；（4）对比孵育前后电化学阻抗变化分析目标物和探针是否结合。
9、进一步的，所述步骤1中，铂丝为对电极，ag/agcl为参比电极，电化学工作站为chi660e，电解质溶液为1 mol/l~2 mol/l的硫酸钠。
10、进一步的，所述步骤2中，将复合膜和ito导电玻璃用工作电极夹固定在一起。
11、进一步的，所述步骤3中，杂交缓冲液为tris缓冲液，浓度为0.1 µmol/l~0.5 µmol/l，目标物的浓度为0.5 µmol/l~2 µmol/l，所述目标物为核酸、蛋白、生物小分子等，所有测试在室温下进行。
12、进一步的，所述步骤4中，目标物与探针相结合产生阻抗，从而引起变化。
13、此外，本专利技术的检测原理为：采用离子径迹-刻蚀技术制备了具有纳米孔道的聚合物膜，在未修饰的聚合物膜纳米孔道表面暴露电离的羧基官能团，它们可以被1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)激活，形成胺反应性酯中间体；然后这些活性酯通过形成共价键与带有氨基的捕获探针进一步缩合，进而得到修饰捕获探针的纳米孔道，最后用带有负电荷的牛血清白蛋白对含有修饰了捕获探针功能化的纳米孔道进行活性位点封闭，从而得到一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器，然后目标物与捕获探针相结合会堵塞纳米孔道，使电化学阻抗增大，进而影响纳米孔道内离子的跨膜运动，通过电化学工作站进行电化学阻抗测试来检测探针和靶标之间的杂交。
14、与现有技术相比，本专利技术有益效果至少在于：本专利技术提供的纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器适用于检测核酸、蛋白、生物分子等，本专利技术利用纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜作为工作电极；多孔膜具有多个纳米孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器，其特征在于，以含有多个纳米孔道的聚合物膜为基材，在聚合物膜的纳米孔道内壁修饰纳米粒子，然后将金属氧化物沉积在聚合物膜纳米孔道尖端表面，制成纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜，然后在膜的纳米孔道表面修饰捕获探针DNA，最后封闭活性位点，得到基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，主要步骤如下：（1）在直线加速器上，用重离子辐照聚合物膜，将聚合物膜每一面在紫外灯下暴露，使其敏化；（2）将聚合物膜包埋在电导池的两个腔间，一个腔内填充蚀刻液，另一个腔内填充阻止液，然后在膜上施加电压，刻蚀过程停止在一个所需的电流值对应于一定的尖端直径；（3）将多孔膜在含有纳米粒子水溶液中浸泡，然后取出修饰有纳米粒子的多孔膜，用水冲洗，在空气中晾干；（4）将纳米粒子修饰的多孔膜置于工作电极上，然后将计数电极和参比电极与工作电极一起置于电解池中，使用电化学工作站对金属氧化物进行电沉积，然后用去离子水中冲洗负载过金属膜的多孔膜，并在
3.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(PET)膜、聚碳酸酯（PC）膜或聚酰亚胺（PI）膜，纳米孔道的形状为锥状，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5 µm，孔密度为1×103~1×1015个/cm2，紫外光的波长300~400 nm，照射时间为2小时。
4.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中化学刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6 mol/L~9mol/L，阻止液为1 mol/L~3 mol/L的氯化钾和1 mol/L~3 mol/L的甲酸，施加电压为1 V，在30℃条件下进行，所需电流值对应尖端直径根据dtip=4LI/Πk(c)UD来计算，其中L为孔长;I是电流;U为施加电压；dtip和D分别为尖端直径和基部直径；k (c)是电解质的比电导率，对于25℃下的1 mol/L的氯化钾溶液，其k (c)为0.11173 Ω-1cm-1。
5.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中纳米粒子为直径10~20 nm的金纳米粒子，浸泡时间为10分钟。
6.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中工作电极为ITO导电玻璃衬底，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极，电化学工作站为CHI660E，电解质溶液为4 mol/L~6 mol/L的金属氧化物溶液，通过恒温器将沉积浴温度保持在30℃。
7.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中EDC的浓度为10 mg/L~15 mg/L，NHS的浓度为3mg/L~5 mg/L，探针DNA水溶液浓度为2 µmol/L~5 µmol/L，pH 7.0~8.0，探针反应时间为12小时，在室温下进行。
8.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中BSA水溶液浓度为8 mg/mL~10 mg/mL，pH 7.0~8.0，浸泡时间为1小时，在室温下进行。
9.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的应用，其特征在于，具体检测过程如下：（1）所有电化学测试均在三电极池中进行，将权利要求1中所示电化学生物传感器金属膜一端固定在ITO导电玻璃上制成工作电极，将对电极和参比电极与工作电极一起置于电解池中，在电解池中加入电解质溶液，频率设为10-2~105 Hz，交流振幅为3 mV~5 mV，使用电化学工作站进行电化学阻抗测试；（2）将修饰过探针的复合膜置于ITO导电玻璃上制成工作电极...
【技术特征摘要】
1.一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器，其特征在于，以含有多个纳米孔道的聚合物膜为基材，在聚合物膜的纳米孔道内壁修饰纳米粒子，然后将金属氧化物沉积在聚合物膜纳米孔道尖端表面，制成纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜，然后在膜的纳米孔道表面修饰捕获探针dna，最后封闭活性位点，得到基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，主要步骤如下：（1）在直线加速器上，用重离子辐照聚合物膜，将聚合物膜每一面在紫外灯下暴露，使其敏化；（2）将聚合物膜包埋在电导池的两个腔间，一个腔内填充蚀刻液，另一个腔内填充阻止液，然后在膜上施加电压，刻蚀过程停止在一个所需的电流值对应于一定的尖端直径；（3）将多孔膜在含有纳米粒子水溶液中浸泡，然后取出修饰有纳米粒子的多孔膜，用水冲洗，在空气中晾干；（4）将纳米粒子修饰的多孔膜置于工作电极上，然后将计数电极和参比电极与工作电极一起置于电解池中，使用电化学工作站对金属氧化物进行电沉积，然后用去离子水中冲洗负载过金属膜的多孔膜，并在室温下干燥；（5）将纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜置于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)水溶液中浸泡2小时，并用纯水彻底冲洗，冲洗完成后进行干燥，然后将处理后的膜浸入带有氨基的捕获探针溶液过夜，最后用蒸馏水对修饰过的膜进行三次洗涤，并在室温下干燥；（6）最后，将捕获探针功能化的复合膜浸入牛血清蛋白（bsa）水溶液中，然后用去离子水清洗，在空气中干燥，即制成了纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器。
3.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚合物膜为聚对苯二甲酸乙二酯(pet)膜、聚碳酸酯（pc）膜或聚酰亚胺（pi）膜，纳米孔道的形状为锥状，厚度为10~50 µm，其表面孔道的孔径为0.1~5 µm，孔密度为1×103~1×1015个/cm2，紫外光的波长300~400 nm，照射时间为2小时。
4.根据权利要求2所述的一种基于纳米粒子修饰多孔膜负载金属膜的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中化学刻蚀液为氢氧化钠溶液，浓度为6 mol/l~9mol/l，阻止液为1 mol/l~3 mol/l的氯化钾和1 mol/l~3 mol/l的甲酸，施加电压为1 v，在30℃条件下进行，所需电流值对应尖端直径根据dtip=4li/πk(c)ud来计算，其中l为孔长;i是电流;u为施加电压；dtip和d分别为尖端直径和基部直径；k (c)是电解质的比电导率，对于25℃下的1 mol/l的氯化钾溶液，其k (c)为0.11173 ω-1cm-1。
5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：阎尔坤，师钰博，杨思思，李烜，
申请(专利权)人：天津市协和医药科技集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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