【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及甾体药物制备，具体为7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法及应用。
技术介绍
1、7α-羟基-去氢表雄酮(7α-oh-dhea)具有控制体重，治疗阿尔茨海默症等功效，是一种重要的甾体药物，市场需求和应用价值极大，传统的化学方法合成7α-oh-dhea需要经过溴代、异构化、酯化、水解等步骤，步骤繁琐，收率偏低，且对环境污染较大。
2、随着细胞转化在甾体药物中的深入研究，现已经广泛应用于甾体药物或药物中间体合成，其具有较高的立体选择性，转化条件温和、环境友好等优势。但现有的羟化工艺普遍存在投料量偏低(10-15g/l)、转化率低(60-70％)和发酵周期长(48-72h)等问题。
3、现有报道转化dhea 7α羟基化的菌株主要有亚麻刺孢、总状毛霉和蓝色犁头霉菌等，但均存在投料浓度低、转化时间长等问题，不适用于工业化生产。中国专利文献cn110885869 a公开了一种利用蓝色犁头霉菌合成7α-oh-dhea的方法，以dhea为底物，其投料浓度为5.5g/l时，转化48h后目标产物的生成率为45.5％；波兰专利文献pl235019b1中公开了一种利用镰刀菌合成7α-oh-dhea的方法，以dhea为底物，其投料浓度为0.2g/l时，转化72h后，通过纯化后收率达到80％，纯度97％。
4、因此，在研究7α羟基化的菌株中，如何提高投料浓度、底物的转化率和缩减转化时间是现有技术中亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供了7α-羟基-去氢表
2、有鉴于此，本专利技术的方案为：
3、7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法，步骤包括：向亚麻刺盘孢菌液中加入去氢表雄酮，在15～20℃温度下转化10～15h得到7α-羟基-去氢表雄酮；所述转化过程向培养体系中加入β-环糊精和吐温80。
4、进一步地，所述β-环糊精添加量量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％；和/或，所述吐温80添加量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％。
5、进一步地，所述亚麻刺盘孢菌液中菌浓度以湿菌重计为40-50g/l。
6、进一步地，所述转化温度优选16℃。
7、进一步地，所述亚麻刺盘孢保藏号为cgmcc，no.3.4486。
8、进一步地，所述亚麻刺盘孢经斜面培养、种子培养及发酵培养后用于7α-羟基-去氢表雄酮制备。
9、优选地，所述斜面培养条件为28℃培养6～7d，所用培养基使用pda固体培养基，包括马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂15～20g/l。
10、优选地，所述种子培养条件为28℃培养40～72h，所述发酵培养条件为28℃培养20～24h；所述种子培养及发酵培养所用培养基包括：葡萄糖30～50g/l、玉米浆10～30g/l、磷酸二氢钾1～5g/l、磷酸氢二钾1～5g/l、硫酸镁0.1～0.3g/l、硝酸钠1～5g/l，ph值为5.5～5.8。
11、优选地，所述种子培养为一级种子培养、或依次进行一级种子培养和二级种子培养；所述一级种子培养的时间为40～48h，摇床转速为200～500rpm，接种量为1％，其中真菌孢子浓度个数浓度108个/ml；所述二级种子培养的条件为28℃培养20～24h，转速200～500rpm，接种量为5～10％，菌浓度以湿菌重计为20～30g/l；所述发酵培养接种量5～10％，菌浓度以湿菌重计为40～50g/l，通气量为1～2vvm。
12、进一步地，所述投料转化过程控制溶氧30±2％，所述投料转化的转速为200～500rpm；所述投料转化的通气量为1.5～2vvm。
13、进一步地，所述7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法还包括将去氢表雄酮转化后的后处理步骤，具体包括：
14、s1.将去氢表雄酮转化液过滤得到菌渣；
15、s2.萃取菌渣，合并萃取液后浓缩至无液体残留；
16、s3.加入甲基异丁基甲酮打浆浓缩，过滤，重复两次得到固体，收集滤液；
17、s4.将所得固体加入水打浆，过滤，得到7α-羟基-去氢表雄酮；合并所得滤液，浓缩，降温析晶后过滤得母液物；
18、s5.将步骤s4所得母液物加入纯水打浆，过滤，得固体，烘干用于返投；
19、重复亚麻刺盘孢菌液中去氢表雄酮转化操作得到返投后的7α-羟基-去氢表雄酮。
20、与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
21、本专利技术所述7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法，通过向亚麻刺盘孢菌液中加入β-环糊精和吐温80，能够将底物dhea投料浓度提高至30g/l，并且可实现15～20℃低温下10-15h完成90％以上的转化率，转化率提高的同时转化时间相比现有的48-72h大幅缩减。所述制备方法有效解决现有技术利用dhea 7α羟基化的菌株存在dhea投料浓度受限、转化率低以及转化时间长等缺陷，对于推进菌株转化工业生产7α-羟基-去氢表雄酮具有显著的意义。
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1.7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，步骤包括：向亚麻刺盘孢菌液中加入去氢表雄酮，在15～20℃温度下转化10～15h得到7α-羟基-去氢表雄酮；所述转化过程向培养体系中加入β-环糊精和吐温80。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-环糊精添加量量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％；和/或，所述吐温80添加量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢菌液中菌浓度以湿菌重计为40-50g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转化温度为16℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢保藏号为CGMCC，NO.3.4486。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢经斜面培养、种子培养及发酵培养后用于7α-羟基-去氢表雄酮制备。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述斜面培养条件为28℃培养6～7d，所用培养基使用PDA固体培养基，包括马铃薯200g/L、葡萄糖
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养为一级种子培养、或依次进行一级种子培养和二级种子培养；所述一级种子培养的时间为40～48h，摇床转速为200～500rpm，接种量为1％，其中真菌孢子浓度个数浓度108个/ml；所述二级种子培养的条件为28℃培养20～24h，转速200～500rpm，接种量为5～10％，菌浓度以湿菌重计为20～30g/L；所述发酵培养接种量5～10％，菌浓度以湿菌重计为40～50g/L，通气量为1～2vvm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述投料转化过程控制溶氧30±2％，所述投料转化的转速为200～500rpm；所述投料转化的通气量为1.5～2vvm。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括将去氢表雄酮转化后的后处理步骤，包括：
...【技术特征摘要】
1.7α-羟基-去氢表雄酮的制备方法，其特征在于，步骤包括：向亚麻刺盘孢菌液中加入去氢表雄酮，在15～20℃温度下转化10～15h得到7α-羟基-去氢表雄酮；所述转化过程向培养体系中加入β-环糊精和吐温80。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述β-环糊精添加量量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％；和/或，所述吐温80添加量为亚麻刺盘孢菌液质量的1～2％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢菌液中菌浓度以湿菌重计为40-50g/l。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转化温度为16℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢保藏号为cgmcc，no.3.4486。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢经斜面培养、种子培养及发酵培养后用于7α-羟基-去氢表雄酮制备。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾勇泉，何鑫，汪声晨，李琦欣，刘明欣，汪洋，刘林，陈海林，赵静，蔡啸，应娟，
申请(专利权)人：黄冈人福药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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