【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种nk细胞及其扩增方法。
技术介绍
1、自然杀伤细胞（nk细胞）是已知的会杀死发生了肿瘤免疫编辑的肿瘤细胞的最主要的免疫细胞，是临床上进行肿瘤细胞免疫治疗的重要手段之一，临床研究表明，异体和自体的nk细胞免疫治疗是安全的。2009年卫生部就曾发布《自体免疫细胞t细胞、nk细胞治疗技术管理规范（征求意见稿）》，把nk细胞免疫治疗技术作为第三类医疗新技术列入了临床治疗的应用范围。但十年来，nk细胞治疗技术并没有在医院得到广泛的应用，在前期的一些临床试验中，自体nk细胞疗法临床应用的疗效并不明显，其中根本原因是，无法得到足够数量和活性的nk免疫细胞影响了nk细胞的治疗效果。但是如果回输的nk细胞量远远小于体内的肿瘤细胞量，治疗效果就会减弱。因此，如何在体外实现nk细胞大规模扩增培养是目前nk细胞治疗的关键问题。
2、脂质体是由磷脂双分子层膜所形成的囊泡，其内部包裹着水性核心。由于脂质体的两亲性，亲水和疏水的药物均能高效地载入到脂质体中。脂质体倾向于将水溶性药物包裹在中心水相中，而将脂溶性药物包裹在双分子膜间的区域。同时，由于生物膜的基本结构也是磷脂双分子层膜，因此脂质体具有良好的生物相容性和生物可降解性。
3、体外大规模扩增nk细胞的两种常用方法包括滋养细胞（k562细胞）刺激法和因子刺激方法。滋养细胞（k562细胞）刺激法以基因工程手段构建滋养细胞，再用改造的滋养细胞刺激nk细胞扩增，利用这种方法得到的nk细胞纯度较高、倍数也较大，但是由于（1）涉及基因转染，成本较高，步骤较为复杂；
4、因此，亟需提供一种有效提高nk细胞增殖能力、提高nk细胞纯度且安全性高的扩增培养方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种nk细胞及其扩增方法，解决了现有技术中，因子刺激法培养的nk细胞增值能力有限、细胞纯度低，滋养细胞法培养的nk细胞引入新遗传物质，安全性顾虑等问题。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种扩增nk细胞的方法，所述方法包括：培养基因修饰的滋养细胞，破碎滋养细胞得到脂质体，使用所述脂质体激活nk细胞进行扩增培养。
4、本专利技术方法使用的基因修饰的滋养细胞能够表达刺激nk生长的细胞因子，本专利技术中的脂质体提取过程不需要额外添加促脂质体分泌的营养液，不会给培养体系带入新物质。本专利技术方法培养nk细胞额外添加的生长因子少，操作简单，本专利技术获得脂质体的方法更清晰简单，使用物理破碎，不给培养体系带入新物质，安全性高，无污染风险。
5、带有il-21的脂质体能刺激nk细胞，促进其成熟、增强细胞杀伤性，以及提高对靶细胞的杀伤率。il-21能诱导nk细胞的成熟，并增强其细胞毒性。il-21r表达于激活的nk细胞上，诱导杀伤细胞产生多种细胞因子，如ifn-γ、穿孔素等，从而提高nk细胞对靶细胞的杀伤率。
6、il-21作为nk细胞成熟的诱导因子，在nk细胞培养中至关重要，并且在培养过程中对其浓度有一定的需求。培养过程中，带有il-21的脂质体可以持续刺激nk细胞，而其他生长因子对il-21的替代性较低，无法达到相同的刺激效果。
7、可以理解，本专利技术中所述基因修饰的滋养细胞过表达il-21，本领域具有相同功能的基因修饰的滋养细胞均适用于本专利技术，可通过基因工程方法进行制备或直接购买，例如从美国atcc生物标准品资源中心、国家生物医学实验细胞资源库购买k562母细胞，再通过脂质体转染或慢病毒转染、电转染方式将il-21基因插入细胞中。
8、优选地，所述基因修饰的滋养细胞过表达il-21；所述滋养细胞包括髓系细胞；所述髓系细胞包括k562细胞；所述nk细胞包括car-nk细胞；所述培养基因修饰的滋养细胞包括使用含有8-12%胎牛血清的基础培养基在35-37℃，co2浓度为3-5%条件下培养基因修饰的滋养细胞，每2-3天补充一次含有8-12%胎牛血清的基础培养基，控制细胞浓度在(0.5-2)×106个/ml。
9、上述8-12%中的点值具体可以选择8%、9%、10%、11%、12%等。
10、上述35-37℃中的点值具体可以选择35℃中、35.1℃、35.2℃、35.4℃、36℃、36.4℃、37℃等。
11、上述3-5%中的点值具体可以选择3%、3.1%、3.2%、3.6%、4%、4.2%、4.6%、5%等。
12、上述0.5-2中的点值具体可以选择0.5、0.6、0.8、1、1.4、1.6、1.8、2等。
13、优选地，所述破碎滋养细胞的方法包括过滤破碎；所述过滤破碎包括收集培养得到的滋养细胞，使用滤膜过滤10-100次，过滤后将破碎的滋养细胞悬液差速离心，得到无细胞核的脂质体；所述滤膜的孔径为0.2-50 μm；所述差速离心包括800-1200 g离心8-15min，去掉沉淀，取上清60000-100000 g离心0.5-2 h。
14、上述10-100次中的点值具体可以选择10次、11次、12次、15次、20次、30次、50次、80次、100次等。
15、上述0.2-50 μm中的点值具体可以选择0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm、1 μm、10 μm、20 μm、30 μm、40 μm、45 μm、50 μm等。
16、上述800-1200 g中的点值具体可以选择800 g、810 g、820 g、900 g、1000 g、1100g、1150 g、1200 g等。
17、上述8-15 min中的点值具体可以选择8 min、9 min、10 min、11 min、12 min、13min、14 min、15 min等。
18、上述60000-100000 g中的点值具体可以选择60000 g、61000g、62000 g、70000 g、80000 g、85000 g、90000 g、95000 g、100000 g等。
19、上述0.5-2 h中的点值具体可以选择0.5 h、0.6 h、0.7 h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：培养基因修饰的滋养细胞，破碎滋养细胞得到脂质体，使用所述脂质体激活NK细胞进行扩增培养；
2.根据权利要求1所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述破碎滋养细胞的方法包括过滤破碎；
3.根据权利要求1所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述激活NK细胞进行扩增培养包括：提取外周血或脐带血中的单个核细胞，在添加脂质体的无血清培养基中培养单个核细胞，每隔2-3天补充一次添加脂质体的无血清培养基，每隔1-2天补充一次脂质体，控制细胞浓度在(0.5-2)×106个/mL，共培养4-12天。
4.根据权利要求3所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述提取外周血或脐带血中的单个核细胞包括将外周血或脐带血血样150-450 g离心8-15 min，去掉上层淡黄色血浆，剩余血液使用缓冲液稀释，稀释后的血液滴加在淋巴细胞分离液上层，350-400 g离心25-35 min，得到中间层的单个核细胞；所述缓冲液与剩余血液的体积比为(1-2):1。
5.根据权利要求3所述的扩增NK细胞的方法，其特
6.根据权利要求3所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述脂质体在无血清培养基中的浓度为10-50000 ng/mL。
7.根据权利要求3所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述共培养的温度为35-37℃，CO2浓度为3-5%。
8.根据权利要求1所述的扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
9.一种NK细胞，其特征在于，所述NK细胞由权利要求1-8中任一项所述的扩增NK细胞的方法扩增得到。
...【技术特征摘要】
1.一种扩增nk细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：培养基因修饰的滋养细胞，破碎滋养细胞得到脂质体，使用所述脂质体激活nk细胞进行扩增培养；
2.根据权利要求1所述的扩增nk细胞的方法，其特征在于，所述破碎滋养细胞的方法包括过滤破碎；
3.根据权利要求1所述的扩增nk细胞的方法，其特征在于，所述激活nk细胞进行扩增培养包括：提取外周血或脐带血中的单个核细胞，在添加脂质体的无血清培养基中培养单个核细胞，每隔2-3天补充一次添加脂质体的无血清培养基，每隔1-2天补充一次脂质体，控制细胞浓度在(0.5-2)×106个/ml，共培养4-12天。
4.根据权利要求3所述的扩增nk细胞的方法，其特征在于，所述提取外周血或脐带血中的单个核细胞包括将外周血或脐带血血样150-450 g离心8-15 min，去掉上层淡黄色血浆，剩余血液使...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈霖，彭昉，俞英豪，张家威，刘慧静，庄敏儿，张怡，吕学维，谷义平，张孝松，陈波，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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