一种生物类黄酮色素制造技术

一种生物类黄酮色素属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种生物类黄酮在观赏植物中的表达。本发明专利技术在于提出一种从观赏植物中克隆出的生物类黄酮。本发明专利技术的生物克隆具体操作步骤为：１、观赏植物的生长培养。２、ＲＮＡ提取；３、基因的克隆；４、巢式ＰＣＲ扩增；５、５’端及其上游序列以ＩＰＣＲ方法获得。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体涉及一种生物类黄酮在观赏植物中的表达。
技术介绍
类黄酮类色素是一类液泡包素，主要存在液泡中，类黄酮的不同色素在液泡中的积累产生了各种花色，同时色素的组成和浓度的不同也是出现各种花色的原因。其中花色素和花色素苷是重要的颜色决定物质，也是花色生理水平的重要检测指标。而类黄酮一3' 5' —羟化酶(F3' 5' H)是合成3' —，5' —带羟基的花色素的关键酶和限速酶，F3'， 5' H基因属于细胞色素450单加氧酶(P450)超家族。细胞色素450单加氧酶(P450)是血红素依赖的氧化酶，广泛分布与各种生物中，具有非常复杂的功能，可以催化成千上万的反应。在植物界分布也非常的广泛，可以催化的反应超过50种，也涉及到类黄酮的合成。它在二氢黄酮醇的3'和5'位置选择性的加入羟基，产生不同的花色素苷从而使得植物显现出不同的颜色。这类色素呈现蓝紫色，是蓝花和紫花形成的原因。因此关于它的研究就成为花色研究领域中重要的一个组成部分。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种从观赏植物中克隆出的生物类黄酮。 为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案，本专利技术的生物克隆具体操作步骤为 1、蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色；植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h ;25 — 28°C )。 2、RNA提取取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加lmLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0. 2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75%乙醇lmL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5 — 10min，溶于20 ii L DEPC水中，测0D值，电泳检测。 3、基因的克隆通过对已发表的F3'5'H基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物F和R，进行RT — PCR。 4、巢式PCR扩增由于基因片段过大，上述步骤无法获得完全基因序列，以3'RACE获得F3' 5' H基因的3'端；提取总RNA，逆转录为cDNA ;依次使用多轮引物包括AP， AUAP，3GSPI， 3GSP2， 3GSP3， 3GSP4进行巢式PCR扩增。 5、5'端及其上游序列以IPCR方法获得将基因组DNA以市售的Xbal、Xho1和Sphl三种酶进行酶切；再酶切产物自连，以反式PCR扩增；进行三轮扩增反应，每一轮均使用前一轮的产物作为模版；最后得到的特异PCR特异产物连接到pGEM — T载体，克隆、测序。使用的引物包括5 — r，5 — 2，5 — 3，5 — 4，5 — 5，5 — 6，5 — 7，5 — 8，3 — lb，3 — 2，3 —33。 本专利技术的有益效果 F3'，5'H基因属于细胞色素450单加氧酶(P450)超家族。细胞色素450单加氧酶(P450)是血红素依赖的氧化酶，广泛分布与各种生物中，具有非常复杂的功能，可以催化成千上万的反应。在植物界分布也非常的广泛，可以催化反应超过50种，也涉及到类黄酮的合成。它在二氢黄酮醇的3'和5'位置选择性的加入轻基，产生不同的花色素营从而使得植物显现出不同的颜色。具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本专利技术。应理解，这些实例仅以用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如Sambrook等分子克隆实验手册(New York :ColdSpring Harbor Labortary PreSS，1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。 实施例1 本专利技术的生物克隆具体操作步骤为 1、蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色。植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h ;25 — 28°C )。 2、 RNA提取。取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加lmLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0. 2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75%乙醇lmL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5 — 10min，溶于20 y L DEPC水中，测0D值，电泳检测。 3、基因的克隆。通过对已发表的F3' 5' H基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物F和R，进行RT — PCR。 4、由于基因片段过大，前述步骤无法获得完全基因序列，以3' RACE获得F3' 5' H基因的3'端。提取总RNA，逆转录为cDNA。依次使用多轮引物包括AP， AUAP， 3GSPI， 3GSP2，3GSP3， 3GSP4进行巢式PCR扩增。 5、5'端及其上游序列以IPCR方法获得。将基因组DNA以市售的Xbal、 Xhol和Sphl三种酶进行酶切。再酶切产物自连，以反式PCR扩增。进行三轮扩增反应，每一轮均使用前一轮的产物作为模版。最后得到的特异PCR特异产物连接到pGEM — T载体，克隆、测序。使用的引物包括5 — r，5 — 2，5 — 3，5 — 4，5 — 5，5 — 6，5 — 7，5 — 8，3 — P，3 —2，3 — 3。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物类黄酮色素，其特征在于，本专利技术的生物克隆具体操作步骤为：　　（１）蝴蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ　ｈｙｂｒｉｄａ）材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Ｆｏｒｍｏｓａ　ｒｏｓａ，花色为紫色，白色，黄色；植物材料在温室正常条件下生长（Ｌ／Ｄ，１６ｈ／８ｈ；２５一２８℃）。　　（２）ＲＮＡ提取：取１００毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加１ｍＬＴｒｉＢｌｕｅ试剂，用力摇１５ｓ，室温放置５ｍｉｎ。加０．２ｍＬ氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置１０ｍｉｎ。用ＤＥＰＣ配制的７５％乙醇１ｍＬ洗涤沉淀，重复一次。室温干燥５一１０ｍｉｎ，溶于２０μＬ　ＤＥＰＣ水中，测０Ｄ值，电泳检测。　　（３）基因的克隆：通过对已发表的Ｆ↓［３］′５′Ｈ基因序列进行同源性比较，根据保守区设计兼并引物Ｆ和Ｒ，进行ＲＴ一ＰＣＲ。　　（４）巢式ＰＣＲ扩增：由于基因片段过大，上述步骤无法获得完全基因序列，以３′ＲＡＣＥ获得Ｆ↓［３］′５′Ｈ基因的３’端；提取总ＲＮＡ，逆转录为ｃＤＮＡ；依次使用多轮引物包括ＡＰ，ＡＵＡＰ，３ＧＳＰＩ，３ＧＳＰ２，３ＧＳＰ３，３ＧＳＰ４进行巢式ＰＣＲ扩增。　　（５）５’端及其上游序列以ＩＰＣＲ方法获得：将基因组ＤＮＡ以市售的ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ和ＳｐｈＩ三种酶进行酶切；再酶切产物自连，以反式ＰＣＲ扩增；进行三轮扩增反应，每一轮均使用前一轮的产物作为模版；最后得到的特异ＰＣＲ特异产物连接到ｐＧＥＭ一Ｔ载体，克隆、测序。...

【技术特征摘要】
一种生物类黄酮色素，其特征在于，本发明的生物克隆具体操作步骤为(1)蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)材料采自上海农业科学院蔬菜园艺研究所，品种为Formosa rosa，花色为紫色，白色，黄色；植物材料在温室正常条件下生长(L/D，16h/8h；25一28℃)。(2)RNA提取取100毫克左右新鲜的材料，液氮充分研磨。加1mLTriBlue试剂，用力摇15s，室温放置5min。加0.2mL氯仿，去蛋白，上清转移至新的离心管，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。用DEPC配制的75％乙醇1mL洗涤沉淀，重复一次。室温干燥5一10min，溶于20μL DEPC水中，测0D值，电泳检测。...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖懿，
申请(专利权)人：肖懿，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]