基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法技术

基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法：其使用作为运算介质的生物分子，通过生化反应，对与癌症相关基因表达情况进行计算；结果符合要求时自动合成并靶向释放抗癌药物：完整的自杀基因；所述作为运算介质的生物分子具体是ＤＮＡ分子和／或酶；与乳腺癌相关的原癌基因为：Ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＥＧＦＲ、ｃ－ｍｙｃ、ｒａｓ、ｉｎｔ－２、ｂｃｌ－２、ＢＡＧ－１、ＢＣＳＧ－２、ｓｕｒｖｉｖｉｎ；与乳腺癌相关的抑癌基因为Ｐ５３、ｎｍ２３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、Ｐ１６、Ｐ２１、ＣＨＥＫ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２。本发明专利技术在条件成立时合成并释放治疗乳腺癌的抗癌药物：完整的自杀基因。该方法与纳米技术和微加工技术相结合，有助于提高治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及计算机科学、分子生物学、医学及微流控芯片技术。特别提供了一种。
技术介绍
癌症是一种基因性疾病，在基因水平进行诊断和治疗是最基本和最准确的方法。 细胞癌变是一个以多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活为基础的过程，因此，在进行基 因诊断时，往往需要对多种基因的表达水平进行综合的判断。目前，癌症的诊断往往是在 体外进行，通过对血液和组织检验结果等进行判断，还远远没有达到单细胞水平。并且， 体外诊断和体内治疗是两个相对独立的环节，抗癌药物对正常细胞往往也造成较大的损 伤。如何将抗癌药物特异性的释放到肿瘤细胞，提高治疗的靶向性，是生物医学工作者们 致力解决的难题。迄今为止，有多种方法和技术被应用于药物的靶向释放中，如利用病毒 (文献Cancer Gene Ther即y， 2008， 15， 667-675)、纳米颗粒(文献Gene Ther即y， 2000， 7， 1896-1905)以及微流控芯片(文献Lab On A Chip, 2006， 6， 1384-1386)等携带药物，但由 于这些体系缺少了 诊断这一环节，因此还不能做到最为准确的靶向治疗。 2004年，Sh即iro小组报道了 一种可控制基因表达的生物分子计算机(文献 Nature, 2004， 429， 423-429)，在试管内模拟了微小的DNA计算机进入细胞后，通过多次的 杂交、酶连、酶切反应，对前列腺癌和肺癌多种相关基因的表达情况依次进行计算，并在诊 断成立时，释放一条较短的单链核酸分子作为药物进行治疗。该计算机首次将诊断和治疗 两个相对独立的环节联系起来，并将诊断和治疗定位在单细胞水平，提高了药物释放的靶 向性，为解决癌症的靶向治疗提供了新的研究方向。但这种DNA计算机如要进一步进行体 内试验尚存在以下几点不足1、该计算机所有的生化反应是在试管中进行的，DNA计算机 要进入体内行使功能，必然需要一种有效的载体携带着DNA分子和酶将其传递到相应的靶 点，防止DNA分子在计算前就被降解掉，显然试管不能成为这种有效的载体；2、对多种癌症 相关基因表达情况采用依次进行(串联)的计算方式，并且每计算一种基因需要引入多种 高浓度的外源性分子，有可能会影响到细胞的正常生理功能；3、该计算机必须要进入细胞 内才能行使功能，增强了操作难度；4、最为重要的一点，该计算机采用限制性内切酶(Fok I 酶)进行酶切反应，限制性内切酶仅存于低等生物内(如细菌、病毒等)，可在特定位点可将 双链DNA分子切断，因此有可能对高等生物的基因组产生影响。综上所述，若要将DNA计算 机应用于基因诊断和治疗中，必须要有更为合理的计算方法和更为理想的平台。另外，上述 体系中所释放的为预先已经存在的药物，一种更为灵活的方法为根据需要合成治疗药物然 后释放(文献NatureBiotechnology，2003，21， 1184-1191)。 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，随着经济水平的提高和生活方式的改变，其发 病率逐年上升，并有年轻化趋势，在一些大城市已跃居女性恶性肿瘤的首位。全世界每年约 有120万妇女患乳腺癌，约50万人死于此病，转移和复发是患者常见的死亡原因。目前的 诊断手段主要有体格检查、X线、B超、远红外线扫描、CT、组织穿剌活检等，但多数人在检5查时已有病灶，甚至已经到了中晚期。目前的治疗手段主要采取手术切除，辅以放疗、化疗、内分泌治疗等，这些方法对病人生理、心理的伤害较大，且5年存活率不高。科学家早已知道，引发癌症的导火索是细胞内基因发生变化。乳腺癌也是一种基因性疾病，其发生和发展是一个多阶段演进、多基因改变的渐进过程。其内在机制在于原癌基因与抑癌基因之间失去平衡，表现为多个原癌基因的异常激活和编码蛋白过度表达以及抑癌的缺失、突变失活导致细胞增殖失控而恶性转化。这些基因变化的相互作用，特别是其叠加作用，是乳腺发生癌变的重要分子基础。因此，在基因水平进行乳腺癌的诊断和治疗，是更为准确、有效、耙向性更强的方法。乳腺癌等的基因诊断背景知识 1)与乳腺癌相关的原癌基因原癌基因为人体细胞固有的基因，其表达产物在正常状态下为细胞增殖分化所必需，在突变、扩增、重排、过表达等特定条件下，被激活诱导细胞发生恶变，导致抑制细胞凋亡、细胞过度增殖和侵袭转移等。与乳腺癌相关的原癌基因有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-l、BCSG-2、survivin等。其中C-erbB-2已被公认为是乳腺癌肿瘤标志物检测中的一个金标准。它是一种细胞来源的原癌基因，翻译的糖蛋白pl85可以促进细胞分裂和蛋白水解酶的分泌，使DNA合成增加，癌细胞生长加快，并增强细胞的运动能力，从而促进肿瘤侵袭和转移。C-erbB-2在正常乳腺细胞中低表达，而在20X 30X的乳腺癌中有C-erbB-2的扩增和(或)过度表达。其高表达提示细胞增殖旺盛、侵袭力强，患者对化疗、内分泌治疗效果欠佳，预后差。 2)与乳腺癌相关的抑癌基因抑癌基因在突变、缺失、甲基化、低表达等条件下，丧失维持细胞正常生理功能的作用，细胞易发生癌变。与乳腺癌相关的原癌基因有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、服CAl、服CA2等。P53是至今发现的与人类肿瘤相关性最为密切的基因。在人类乳腺癌的突变率为15% 60%。 p53基因分为野生型和突变型两种。野生型p53能抑制多种原癌基因，为一种抑癌基因，它能够诱导终末分化、维持基因稳定，触发衰老和诱导细胞凋亡，是负生长调控因子，正常细胞内p53基因为野生型。突变型P53基因失去了野生型p53基因抑制细胞增殖的正常功能，并且具有了癌基因的特性。突变型p53高表达的乳腺癌具有强的侵袭力、转移力，并与淋巴结转移密切相关，预后不良，可作为判断乳腺癌预后的一个重要指标。nm23，又称为肿瘤转移抑制基因，为人类正常基因，广泛存在于机体细胞膜和细胞浆上。目前一般认为nm23是通过影响微管装配、信号转导、翻译调节及细胞黏附而维持细胞的正常分裂状态，从而抑制癌细胞的侵袭、转移。其高表达与淋巴结转移及远处转移呈负相关，与生存率呈正相关，对判断乳腺癌淋巴结转移和评估预后具有重要意义。BRCA1、BRCA2为肿瘤易感基因，这两个基因发生变异的女性，有40X 80%的患乳腺癌的危险，且预后不好。可作为肿瘤预测基因，用于乳腺癌早期监控。 3)基因诊断采用的方法和平台说明 基因诊断主要采用PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR) 、Southern印迹、斑点印迹、荧光原位杂交(FISH)等方法反映基因扩增情况。借助的平台主要为试管、基因芯片和微流控芯片等。 基因芯片又称为生物芯片，采用微阵列的方式，将上万种寡核苷酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上。通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，经电脑系统处理，分析所得资料。基因芯片具有大规模、高通量的优势，能将肿瘤发展过6程中多个基因作为一个基因群来研究。 微流控芯片，又称为芯片实验室，(lab-on-a-chip)，指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室。它可将单细胞捕获、裂解、DNA固相萃取、PCR、电泳、激光诱导荧光检测等集成在一块几平方厘米的芯本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于：所述基因治疗乳腺癌的药物的制备方法是：使用作为运算介质的生物分子，通过生化反应，对与癌症相关的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一种或其组合的表达情况进行计算；当计算结果符合要求时自动合成并靶向释放有效的抗癌药物：完整的自杀基因；在其所述的计算过程中，所述作为运算介质的生物分子具体是ＤＮＡ分子和／或酶；与乳腺癌相关的原癌基因包含有：Ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＥＧＦＲ、ｃ－ｍｙｃ、ｒａｓ、ｉｎｔ－２、ｂｃｌ－２、ＢＡＧ－１、ＢＣＳＧ－２、ｓｕｒｖｉｖｉｎ；与乳腺癌相关的抑癌基因包含有：Ｐ５３、ｎｍ２３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、Ｐ１６、Ｐ２１、ＣＨＥＫ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２。

【技术特征摘要】
基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征在于所述基因治疗乳腺癌的药物的制备方法是使用作为运算介质的生物分子，通过生化反应，对与癌症相关的所有原癌基因和抑癌基因中的至少一种或其组合的表达情况进行计算；当计算结果符合要求时自动合成并靶向释放有效的抗癌药物完整的自杀基因；在其所述的计算过程中，所述作为运算介质的生物分子具体是DNA分子和/或酶；与乳腺癌相关的原癌基因包含有C-erbB-2、EGFR、c-myc、ras、int-2、bcl-2、BAG-1、BCSG-2、survivin；与乳腺癌相关的抑癌基因包含有P53、nm23、PTEN、Rb、P16、P21、CHEK2、BRCA1、BRCA2。2. 按照权利要求1所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物的制备方法中，作为运算介质的DNA分子具体为与 每种癌症相关基因相对应的计算分子和药物片段分子，以及带有多个缺口的不完整的自杀 基因分子；所述自杀基因分子上缺口的序列和数量与药物片段分子的序列和数量相对应。3. 按照权利要求2所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述作为运算介质的DNA分子中，与每种癌症相关基因相对应的计算分子和药物片 段分子为单链DNA分子，带有缺口的不完整的自杀基因分子为双链DNA分子。4. 按照权利要求3所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物的制备过程中，当被检测对象中对应的癌症相关基 因表达超出正常范围时，超出部分的癌症相关基因可将全部或部分的药物片段分子从其与 计算分子的匹配关系中置换取代下来，使原有的计算分子与癌症相关基因杂交的结构变为 新的更为稳定的结构；当癌症相关基因的表达不符合诊断标准时，亦即药物片段分子中的部分或者全部没有 从其与计算分子的匹配关系中被置换取代下来时，就不能与带有缺口的不完整的自杀基因 分子结合形成完整的自杀基因分子从而具有抗癌作用。5. 按照权利要求4所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于所述基因治疗乳腺癌的抗癌药物制备方法中所使用的作为运算介质的酶为T4DNA连 接酶；所述药物片段分子与计算分子在结构上互补，其二者能够实现杂交；具体而言，所述药 物片段分子与不完整的自杀基因分子上的缺口序列相同；药物片段分子在T4DNA连接酶的 作用下能够将不完整的自杀基因上的缺口填补，使其形成完整的自杀基因；相对于药物片段分子而言，癌症相关基因与计算分子互补序列较长，癌症相关基因更 易于与计算分子杂交而将药物片段分子取代下来。6. 按照权利要求5所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代下来 后，被取代下来的药物片段分子在电场作用下靶向释放到对应的目的区域；从而与不完整 的自杀基因在T4DNA连接酶体系中合成具有抗癌作用的完整药物。7. 按照权利要求6所述基于微流控芯片的基因治疗乳腺癌的药物的制备方法，其特征 在于当癌症相关基因将相应的药物片段分子从其与计算分子的匹配对应关系中取代下来 后，药物片段分子被输送到特定的目标区域和不完整的自杀基因杂交并在T4DNA连接酶的 作用下进行酶连反应，将相应的缺口填补；所述的特定目标区域中包含有不完整的自杀基因；当癌症相关基因的表达符合要求时，相应的药物片段将不完整的自杀基因上的缺口全 部填补，此时即有完整的自杀基因被合成并作为抗癌药物释放；只要有一种基因表达不符合诊断标准，缺口就不会被完全填补，对应地就不能有完整 的自杀基因被合成，释放的仅为没有抗癌作用的不完整的自杀基因。8. 按照权利要求1 7其中之一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦建华，张宇，于浩，林炳承，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]