【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞，特别涉及一种携带或不携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的应用和制备方法。
技术介绍
1、肝衰竭是严重威胁人类生存的一种疾病，全球急性肝衰竭（acute liverfailure）的发病率约为1-6人/1000000，另外全球约有2.57亿慢性hbv感染者，而我国慢性hbv感染者约7000万例，由此产生的终末期肝病（如hcc或慢加急性肝衰竭，aclf）数量非常巨大。肝移植是治疗肝衰竭最有效的手段，但肝源短缺制约了其大量使用。即使治疗手段越发多样化，但肝衰竭死亡率仍高达30%-70%。不同的治疗手段都存在着不同的缺陷，而人工肝及肝细胞移植等治疗方式也因为弥补不了肝细胞耗竭或组织排异等问题受到空前挑战。
2、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）几乎存在于出生后的所有组织器官，可大量获取，比胚胎干细胞和诱导多能干细胞全能性稍低，相对更安全。传统认为间充质干细胞主要通过分化为靶细胞和旁分泌调节免疫微环境来实现疾病治疗。但随后有研究表明，间充质干细胞异体移植存在组织排斥，短期内会被宿主清除，在体分化为靶细胞的比例非常少。因此推测间充质干细胞主要通过旁分泌机制发挥治疗作用
3、外泌体（exosomes）是一种起源于内吞的小囊泡，直径约50-150nm，多种细胞类型均可分泌产生，外泌体内含有丰富的蛋白、dna和rna，尤其是非编码rna。由于外泌体具有生物膜结构，在体容受性好，易于传递，泡内“信号分子”可通过旁分泌和内分泌途径来影响细胞的各种生物学
4、现有技术中公开了大量采用外泌体或携带mir-122的间充质干细胞来治疗肝损伤的专利，如申请号为cn201610016951.7的专利公开了一种外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的用途，所述外泌体是由人经血间充质干细胞分泌的外泌体，所述外泌体是从经血间充质干细胞的原代培养上清液中分离得到的。优选地，所述外泌体来源于健康人体，更优选地来源于健康的年轻女性，例如年龄为16-25岁的女性，因为其活力更高。该专利存在如下问题：1是健康的年轻女性的获取难度大，2是原代培养上清液的产量较低，导致成本高。如申请号为cn201310390760.3的专利公开了一种携带mir-122的脂肪来源的间充质干细胞在制备肝纤维化治疗制剂的应用，所述携带mir-122的脂肪来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的基本特性和分化潜能；所述携带mir-122 的脂肪来源的间充质干细胞可抵御hbv对间充质干细胞的感染。该间充质干细胞治疗存在以下问题：1、间充质干细胞的细胞较大，在动物模型中注射容易引起栓塞；2、肝损伤的微环境已经发生变化，不适宜间充质干细胞的分化和生长，影响间充质干细胞的治疗效果。
技术实现思路
1、本专利技术实施例提供了一种携带或不携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的应用和制备方法，所述方案如下：
2、一方面，本专利技术实施例提供了一种携带或不携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的应用。
3、其中，包括刀豆蛋白a注射造成的肝衰竭模型或lps/d-galn腹腔注射造成的肝衰竭模型。
4、其中，外泌体是从小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞的培养基上清液分离得到，再通过常规的纯化方法得到。
5、其中，携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的来源是：通过mir-122-5p的模拟物转染小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞，分离培养基上清液得到。
6、其中，外泌体的尺寸为50-150nm，本试验制备的外泌体平均尺寸约为131.4nm。外泌体的表面标志物cd63和tsg101均表达。携带或不携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体均高表达mir-122-5p，携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的mir-122-5p的含量更高，本专利中证明了mir-122-5p为治疗肝衰竭的主要物质。
7、另一方面，本专利技术实施例还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体和前述的外泌体等。其中，药物组合物的剂型可以为常见的各种剂型；优选地，药物组合物的剂型为注射剂。药学上可接受的载体可以包括磷酸盐缓冲液和/或生理盐水等。
8、又一方面，本专利技术实施例还提供了前述外泌体的制备方法，所述方法包括：
9、s101间充质干细胞的制备：从小鼠中获取小鼠股骨和胫骨，剥离干净附着在骨表面的肌肉组织，剪去长骨骺端，直接采用间充质干细胞培养基冲洗骨髓腔，骨髓腔冲洗液置于培养皿中培养，24h内换液去除非贴壁细胞，后2-3天完全更换培养基，5-8天采用胰酶消化贴壁细胞，按1：2传代比例进行传代，取第3-5代间充质干细胞。
10、s102外泌体的制备：收取间充质干细胞第3-5代培养基上清液，待细胞生长至70%-80%密度，将培养基更换为不含外泌体血清配制的间充质干细胞培养基，培养24h后，收取细胞上清液，离心去除细胞和细胞碎片，利用超滤管浓缩细胞上清液，采用试剂盒法提取外泌体，采用pbs溶解外泌体沉淀。
11、进一步地，携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法为：在步骤s102中，在p3-p5代间充质干细胞中采用lipofectamine rnaimax转染mir-122-5p的模拟物，再使用转染48h后的细胞上清获取外泌体。具体可以参见后续制备包裹mir-122-5p抑制物的过程。
12、本专利技术的骨髓间充质干细胞来源的外泌体能够治疗急性肝衰竭，能显著改善小鼠肝脏功能及组织炎症充血，提升小鼠存活率。同时，该外泌体制备简单、产量高。
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1.携带或不携带外源miR-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝衰竭包括刀豆蛋白A注射造成的肝衰竭模型或LPS/D-GalN腹腔注射造成的肝衰竭模型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体是从小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞的培养基上清液分离得到。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述携带外源miR-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的来源是：通过miR-122-5p的模拟物转染小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞，分离培养基上清液得到。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体的尺寸为50-150nm，其表面标志物包括CD63和TSG101，其高表达miR-122-5p。
6.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和如权利要求1所述的外泌体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂。
8.如权利要求1所述的外泌体的制备方法，其
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，携带外源miR-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法为：在步骤S102中，在P3-P5代间充质干细胞中采用LipofectamineRNAiMAX转染miR-122-5p的模拟物，再使用转染48h后的细胞上清获取外泌体。
...【技术特征摘要】
1.携带或不携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体在制备治疗急性肝衰竭的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝衰竭包括刀豆蛋白a注射造成的肝衰竭模型或lps/d-galn腹腔注射造成的肝衰竭模型。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外泌体是从小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞的培养基上清液分离得到。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述携带外源mir-122-5p的骨髓间充质干细胞外泌体的来源是：通过mir-122-5p的模拟物转染小鼠的骨髓的第3-5代间充质干细胞，分离培养基上清液得到。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾怡，潘青波，任红，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：
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