【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，尤其是涉及一种细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片及人源化肝脏动物模型的构建方法和应用。
技术介绍
1、肝病是指发生在肝脏的病变，肝病的种类繁多，其包括甲肝，乙肝，丙肝，脂肪化，肝癌，肝硬化，酒精性或非酒精性肝病等。肝病是导致肝硬化和肝功能衰竭的重要因素。持续的炎症和肝细胞的持续凋亡激活了肝星状细胞，加速了肝纤维化的形成，最终导致肝硬变和最终的肝功能衰竭。肝功能衰竭是一种多方面的临床综合征，以各种表现为特征，包括但不限于黄疸、凝血障碍，晚期为多器官功能障碍。
2、目前临床上已有多种治疗方案，原位肝移植是目前治疗肝衰竭最有效和最成熟的方法，但是由于肝源短缺、成本高以及终身免疫抑制的要求，其使用受到限制。此外还有一些新的治疗方法被用于肝衰竭相关肝功能障碍代偿的治疗，包括肝细胞移植、血浆置换、生物人工肝等，可部分改善肝脏损伤带来的系统性症状，一定程度缓解病程，但是因为这些方法实际上是一种肝脏替代策略，并不能改善肝脏局部炎症浸润，无法从根源上阻断炎症因子风暴的产生，延长治疗时长，限制治疗效果。
3、针对上述肝病，构建人源化肝脏是一种有重要研究和应用价值的技术方法，除了可以用于对肝毒性药物的毒性机制研究，还可以直接用于肝衰竭的肝功能替代治疗研究。但现有的人源化肝脏的构建方法主要为将肝细胞直接注射入动物体内，效率低，风险大，且构建的人源化肝脏模型不稳定，因此基于现有技术的现状，一种高效、安全、稳定，同时可以促进肝衰竭肝脏组织再生修复的人源化肝脏构建方法是目前需要的。
技术实现
1、本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片及人源化肝脏动物模型的构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
3、本申请提供了一种细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，包括以下步骤：
4、s1、取组织块，对组织块进行脱细胞处理，获得脱细胞支架，将脱细胞支架冻干、研磨，制得细胞外基质粉末；将细胞外基质粉末置于消化液中消化，并加入低聚氨基甲酸乙酯混合，获得预凝胶；
5、s2、对间充质干细胞预处理，利用成肝诱导组合物对经过预处理的间充质干细胞进行成肝诱导；
6、利用第一成熟诱导组合物对经过成肝诱导处理的间充质干细胞进行第一次成熟诱导，获得肝细胞样细胞hlcs；利用第二成熟诱导组合物对所述肝细胞样细胞hlcs进行第二次成熟诱导，获得功能性肝细胞样细胞；
7、s3、将步骤s1制备的预凝胶、间充质干细胞和步骤s2制备的功能性肝细胞样细胞混合均匀，静置凝固，待功能性肝细胞样细胞聚集形成球体，制得细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片。
8、在本申请的技术方案中，本申请制备的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片不仅具有良好的流体力学、温敏性和抗菌性能，其中含有的mscs和hlcs的复合细胞聚集体可以分泌大量细胞因子，通过调节分子信号通路、抑制天然免疫细胞活化减轻炎症浸润，还能通过激活适应性免疫系统的细胞，为维持体内的免疫动态平衡创造耐受性环境，降低肝细胞凋亡，促进肝再生。且由于其中含有的细胞外基质的多种生物活性分子，有利于细胞的黏附和生长，对治疗后炎症的修复及组织的重建有极大的益处。通过该方式构建的人源化肝脏更加高效、安全、稳定，对肝病治疗研究具有重要的理论和应用价值。
9、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)介导的器官修复和再生，以其固有的自我复制和多向分化能力以及良好的抗肿瘤修复能力而备受关注。mscs具有供体细胞来源丰富，手术损伤小，免疫排斥少，费用低，安全性好等优点，本实验创新性地从人脐带中提取出同源的mscs并将其与功能性肝细胞样细胞(hlcs)共培养形成细胞聚集体，通过构建细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片，能够有效将人源细胞安全稳定地填充入小鼠受损肝脏，实现对frg免疫缺陷小鼠人源化模型的构建，该构建技术除了用于构建人源化肝脏研究模型外，该技术方案的思路还可用于构建其他人源化器官的模型，这将为构建人源化肝脏和肝病的治疗研究开辟新的方向。
10、优选地，所述组织块为脐带组织块；间充质干细胞为人脐带来源间充质干细胞。功能性肝细胞样细胞为功能性人肝细胞样细胞。
11、本申请使用脐带作为制备细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的组织材料，脐带作为人体组织医疗废弃物的特殊属性，来源充分，不涉及种属及伦理道德问题。细胞外基质(extracellular matrix，ecm)是由大分子构成的生物网络结构，是通过理化方法去除生物体组织中的细胞成分后的天然生物衍生材料，主要成分有胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、氨基聚糖以及部分天然组织中的生物活性物质，能够为细胞生长提供物理支持和适宜的场所，促进细胞的粘附、生长、增殖和分化和损伤组织器官的再生。本申请所提取的人脐带细胞外基质水凝胶，经过脱细胞处理和重构后，能够有效保存ecm的理化信号和生物学性能，为细胞接种提供机械支撑底物和生物3d载体，内部呈现的多孔网状结构有助于再生细胞的附着和迁移，，能够为脐带来源mscs提供最适合的生长增殖微环境，温敏的特性可在体温的作用条件下凝胶成型，利于附载药物的靶向递送和缓控释放，富含促进细胞旁分泌作用的蛋白(载脂蛋白、hsp90、anxa1-a6等)。通过构建细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片，极大提高细胞进入体内后在靶部位的留存率和作用时间，使细胞能够在体内维持它们的活性和长期的激活，更好地发挥构建人源化肝脏的作用。其可在人体温下成胶，具有安全、高效、可控性强等优点，且在体内易于降解不会引起强烈的免疫排斥反应。原材料人脐带为天然来源，减少排斥风险，最终可以自行降解。
12、作为本申请所述细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法的优选实施方式，所述步骤s1中脱细胞处理包括：
13、对组织块使用胰酶和乙二胺四乙酸的混合溶液、含有青霉素/链霉素的喜树碱溶液、磺基甜菜碱溶液、乙二胺四乙酸、dna酶和rna酶的混合液、十二烷基硫酸钠、triton x和脱氧胆酸钠进行脱细胞处理，获得脱细胞支架。
14、作为本申请所述细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法的优选实施方式，所述胰酶和乙二胺四乙酸的混合溶液中胰酶的质量浓度为0.02％，乙二胺四乙酸的质量浓度为0.05％；所述含有青霉素/链霉素的喜树碱溶液中喜树碱的质量浓度为20μm；所述磺基甜菜碱溶液的质量浓度为125mm；所述dna酶和rna酶的混合液中dna酶的终浓度为0.1％，rna酶的终浓度为0.05％；十二烷基硫酸钠的质量浓度为0.1％；triton x-100的质量浓度为3％和脱氧胆酸钠的质量浓度为4％。
15、本申请确立了将所述组织块使用上述浓度胰酶和乙二胺四乙酸的混合溶液、含有青霉素/链霉素的喜树碱溶液、磺基甜菜碱溶液、乙二胺四乙酸、dna酶和rna酶的混合液、十二烷基硫酸钠、triton x和脱氧胆酸钠的联合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中脱细胞处理包括：
3.如权利要求2所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，
4.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，对间充质干细胞预处理的的试剂包括20ng/mL的表皮生长因子和10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。
5.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述成肝诱导组合物包括30ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL的肝细胞生长因子和0.61g/L的烟酰胺；
6.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述间充质干细胞和步骤S2制备的功能性肝细胞样细胞的细胞密度比为9×106个：1×106个。
7.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片
8.如权利要求1～7任一项所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法制备的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片。
9.一种人源化肝脏动物模型的构建方法，其特征在于，将如权利要求8所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片体内转移到FRG免疫缺陷动物中，得到人源化肝脏动物模型。
10.如权利要求8所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片在制备治疗肝衰竭产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中脱细胞处理包括：
3.如权利要求2所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，
4.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中，对间充质干细胞预处理的的试剂包括20ng/ml的表皮生长因子和10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
5.如权利要求1所述的细胞复合型重构细胞外基质水凝胶贴片的制备方法，其特征在于，所述成肝诱导组合物包括30ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、20ng/ml的肝细胞生长因子和0.61g/l的烟酰胺；
6.如权利要求1所述的细胞复合型...
【专利技术属性】
技术研发人员：易笑，黄岩，
申请(专利权)人：安徽黑豆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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