【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药，具体地，本专利技术涉及一种苯丙氨酸裂解酶突变体及其偶联物或其药学上可接受的盐，更具体地，本专利技术涉及一种苯丙氨酸裂解酶突变体、核酸分子、表达载体、重组细胞、苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐、聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体、药物组合物及其用途和降低苯丙氨酸裂解酶免疫原性同时保持苯丙氨酸裂解酶酶活的方法。
技术介绍
1、苯丙酮尿症(phenylketonuria,pku，又称为苯丙氨酸羟化酶缺乏症)是由肝脏内苯丙氨酸羟化酶缺乏或活性降低而引起的苯丙氨酸代谢障碍疾病，是一种隐性遗传疾病。苯丙氨酸是人体必需氨基酸，参与多种生理活动，但人体不能合成，须由食物摄入。正常情况下，摄入的苯丙氨酸除用于合成各种蛋白外，其余部分在苯丙氨酸羟化酶的作用下转变为酪氨酸，再经其它酶作用转化为多巴、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素或黑色素等。苯丙酮尿症患者因体内苯丙氨酸羟化酶(pah)缺乏或活性降低，不能有效降解苯丙氨酸，一方面造成患者血浆内苯丙氨酸蓄积，当血浆中苯丙氨酸浓度超过肾阀值后通过尿液排出体外，产生苯丙氨酸尿；另一方面，蓄积的苯丙氨酸通过其它次代谢途径生成苯丙酮酸、苯乳酸等对大脑及其它神经系统有毒害作用的物质。
2、该病属于隐性遗传疾病，患儿出生后由于缺乏苯丙氨酸羟化酶(pah)活性，无法有效降解哺乳或饮食产生的苯丙氨酸，造成体内苯丙酮酸等对神经系统有毒害作用物质的蓄积，进而影响大脑等神经系统的发育，随年龄的增长而出现严重智力损伤，同时伴随其它异常行为，如癫痫等。肝脏中pah的活性受损导致的苯
3、目前针对苯丙酮尿的治疗主要有饮食控制疗法、bh4(四氢生物喋呤)替代疗法和药物疗法等3种。
4、饮食控制疗法通过降低患者饮食中苯丙氨酸的含量来减少血浆内苯丙氨酸及苯丙酮等的蓄积，同时辅助以5-羟色胺、l-多巴胺治疗。该方法虽对病症有所控制，但长期坚持患者的依顺性和生活质量难以得到保障，且不能消除由苯丙氨酸水平升高引起的受损的神经学效应，怀孕期间的饮食控制同样可能导致胎儿先天缺陷，患儿饮食治疗期间一些营养物质的缺乏，对于脑发育同样有害。
5、bh4替代疗法通过服用生理剂量的bh4来降低体内苯丙氨酸的浓度，但并非对所有患者有效。目前，用于治疗苯丙酮尿症的此类药物仅有biomarin公司和日本三得利公司(suntory)公司上市的两种药物，但均针对异型高苯丙酸血症(即二氢喋呤还原酶或合成酶缺失引起的高苯丙酸血症)，而无法治疗苯丙氨酸羟化酶缺乏导致的苯丙酮尿症。
6、因此，亟需开发一种可有效治疗苯丙酮尿症等高苯丙氨酸相关性疾病的药物。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物，该偶联物具有免疫原性低和体内半衰期长等优点，可用于预防和治疗苯丙酮尿症等高苯丙氨酸相关性疾病。
2、本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
3、苯丙氨酸裂解酶是一种广泛存在于植物中的非哺乳动物酶(如圆红冬酵母、深红酵母、马铃薯、小麦、地衣、链霉菌、多变鱼腥藻等)，其活性形式为同源四聚体，可将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和氨，并进一步代谢为马尿酸从尿液中排除体外。早在20世纪90年代末，已有研究者将圆红冬酵母来源的苯丙氨酸裂解酶进行小鼠皮下注射或口服降低其血浆中苯丙氨酸水平，但受限于微生物或植物来源的苯丙氨酸裂解酶进入人体后会因免疫反应而很快失效，且在人体不稳定，易受到蛋白水解酶的降解而失去活性。
4、在pku模型小鼠治疗试验中，来源于圆红冬酵母的r.h.pal、斑点球藻的n.p.pal、凤藻的p.c.pal和多变鱼腥藻的a.v.pal等四种不同来源的野生型pal蛋白被用于测试，r.h.pal和a.v.pal及其聚乙二醇化偶联物因具有最高的酶比活性以及在最适反应ph、km参数、蛋白酶抗性和热稳定性方面的优势，被认为更适合用于pku小鼠的治疗，推测这可能与其野生型序列所携带的氨基酸数量和分子性状有关。
5、目前，上市聚乙二醇化苯丙氨酸裂解酶药物pegvaliase的iii期临床研究结果显示，在接受聚乙二醇化苯丙氨酸裂解酶治疗的261名受试者中，72.0％和32.6％分别达到了≥12个月和≥24个月的研究终点，65％的受试者仍在接受治疗。在24个月内，68.4％的参与者达到血液phe≤600μmol/l，60.7％的参与者达到血液phe≤360μmol/l，和51.2％达到血液phe≤120μmol/l。给药期间，血清中苯丙氨酸含量暂时得到了有效控制，但随给药次数增加，anti-pal igm/igg抗体滴度逐步升高，由此引起的血药清除，使得必须不断提高给药剂量和给药频率以维持药效。
6、然而，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本专利技术的实施例，与苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体具有如下位点的突变：第72位、第240位、第467位和第544位中的至少之一。本专利技术通过对苯丙氨酸裂解酶的上述特定位点进行突变，得到的苯丙氨酸裂解酶突变体通过聚乙二醇修饰后，既可提高聚乙二醇的平均修饰度，还可提高酶活保留率，且可降低免疫原性以及将血药维持至5～7天。
7、在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种核酸分子。根据本专利技术的实施例，编码前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本专利技术实施例的核酸分子所编码前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。
8、在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，携带前述的核酸分子。根据本专利技术实施例的表达载体可有效实现前述的苯丙氨酸裂解酶突变体的表达，进而实现苯丙氨酸裂解酶突变体的体外大量获得。
9、在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种重组细胞。根据本专利技术的实施例，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的苯丙氨酸裂解酶突变体。
10、在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐。根据本专利技术的实施例，所述苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐包括：前述的苯丙氨酸裂解酶突变体；修饰基团，所述修饰基团与所述苯丙氨酸裂解酶突变体相连。本专利技术的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐具有聚乙二醇的平均修饰度高、酶活保留率高、免疫原性低和血药维持时间长等优点。
11、在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体。根据本专利技术的实施例，所述苯丙氨酸裂解酶突变体中至少下列氨基酸位点具有peg修饰：k72、k240、k467和k544。本专利技术的聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体具有平均修饰度高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，与苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体具有如下突变位点：
2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，所述突变位点是以SEQID NO:1所示的氨基酸序列进行定位的；
3.根据权利要求1所述的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，与SEQ ID NO:1～2任一项所示的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体包括E72K、Q240K、R467K和R544K中的至少之一的突变位点；
4.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～3任一项所述的苯丙氨酸裂解酶突变体；
5.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求4所述的核酸分子；
6.一种重组细胞，其特征在于，包括：
7.一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述修饰基团为聚乙二醇；
9.一种聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，所述苯丙氨酸裂解
10.根据权利要求9所述的聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，所述PEG修饰用的聚乙二醇的分子量为2～40KDa，优选2～10KDa；
11.一种药物组合物，其特征在于，包括：
12.权利要求1～3任一项所述的苯丙氨酸裂解酶突变体、权利要求7～8任一项所述的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐、权利要求9～10任一项所述的聚乙二醇修饰的苯丙氨酸裂解酶突变体或权利要求11所述的药物组合物在制备药物上的用途，所述药物用于预防和/或治疗高苯丙氨酸相关性疾病；
13.一种降低苯丙氨酸裂解酶免疫原性同时保持苯丙氨酸裂解酶酶活的方法，其特征在于，包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述突变位点是以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行定位的；
...【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，与苯丙氨酸裂解酶的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体具有如下突变位点：
2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，所述突变位点是以seqid no:1所示的氨基酸序列进行定位的；
3.根据权利要求1所述的苯丙氨酸裂解酶突变体，其特征在于，与seq id no:1～2任一项所示的氨基酸序列相比，所述苯丙氨酸裂解酶突变体包括e72k、q240k、r467k和r544k中的至少之一的突变位点；
4.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～3任一项所述的苯丙氨酸裂解酶突变体；
5.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求4所述的核酸分子；
6.一种重组细胞，其特征在于，包括：
7.一种苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的苯丙氨酸裂解酶突变体偶联物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述修饰...
【专利技术属性】
技术研发人员：范开，付志成，唐光辉，吴坤灿，曾鑫，栾秋洋，刘日勇，陈清，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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