【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及一种高保真等温核酸扩增检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、核酸是生物体不可或缺的基本单元，不仅储存遗传信息，编码蛋白质，而且在疾病诊断、食品安全检测、法医鉴定等许多领域被视作重要的生物标志物。kary mullis等在1983年专利技术了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)，并借助从水生栖热菌中分离出的耐热型dna聚合酶，使pcr自动化成为可能。自此，这一技术迅速发展，成为核酸检测领域应用最广泛的方法之一。然而，pcr依赖于耐热dna聚合酶和精密的温控仪器，使其在即时检测中的应用受限。为了满足现场检测的需求，研究者们开发了等温核酸扩增技术。与pcr相比，等温核酸扩增技术避免了严格的高温变性、退火和延伸的变温要求，即在恒温条件下进行快速扩增。等温核酸扩增技术已成为一种很有前景的pcr替代方法，非常适合在资源有限的地区使用。
2、然而，由于等温核酸扩增反应温度低，且难以通过化学的方式精确控制反应起始，易在反应组分预混过程中导致预扩增问题，最终影响检测的灵敏度。环介导等温扩增(lamp)和解旋酶依赖性扩增(had)通常能够避免在反应组分预混过程中出现的预扩增。因为这类热启动的扩增通常在60-65℃下进行，只有将体系置于高反应温度时扩增才会启动。而在低反应温度下进行的等温核酸扩增(扩增温度通常为25-42℃)，在组分混合后立即触发扩增，即使在室温下也是如此。在低反应温度下进行扩增的方法中，最具典型的就是重组酶聚合酶等温扩增(rpa)。rpa反应的起始由镁离
3、因此，本专利技术发展一种灵敏度高、通用性强、操作简单的单管核酸检测方法是本领域重要的科学课题。
4、本专利技术提出一种操作简单、通用性强的策略，消除反应组分预混过程中导致的预扩增。并基于现有等温核酸扩增技术，发展一种灵敏度高的单管核酸检测新方法。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的在于提供一种高保真等温核酸扩增检测方法及试剂盒，以解决上述
技术介绍
提出的反应组分预混过程中导致的预扩增问题。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现的：
3、步骤(1)将高保真等温核酸扩增检测体系配制成预混液，加入目标核酸混合成单管混合体系；
4、步骤(2)将单管混合体系置于特定波长的光源下照射一定时间，然后放入一定温度下的荧光仪中进行等温扩增，同时实时记录荧光信号。
5、步骤1所述高保真等温核酸扩增检测体系包括一对光笼引物/常规引物、荧光报告探针、等温扩增原料、反应缓冲液、等温扩增酶和目标核酸；
6、进一步地，所述光笼引物及常规引物是根据靶标核酸序列设计的，其长度为5～100nt；
7、进一步地，所述光笼引物的3'端是至少具有光敏分子以及3'末端阻断分子两种修饰的核苷酸序列，其使得引物暂时失去延伸功能；
8、进一步地，所述光笼引物是由两段区域组成，上游是与靶标完全互补的引物区域，下游是与靶标不互补的封闭区域。两个区域之间由光敏分子连接，所述3'末端阻断分子修饰于所述光笼引物的3'末端；
9、进一步地，所述光敏分子选自邻硝基苄基(o nitrobenzyl，onb)及其衍生物、香豆素(coumarin，cm)及其衍生物中的至少一种；所述光笼引物中光敏分子的修饰个数为1～100个，其中每隔1～100个碱基嵌入修饰一个光敏分子；
10、进一步地，所述3'末端阻断分子包括胺、磷酸盐、c3 spacer、生物素-teg中任意一种，修饰个数至少为1个；
11、进一步地，所述光敏分子具有光照断键特性，其在经特定波长的光源激发后断键，所述光敏分子与引物分离，仅留下带有3'-末端磷酸基团的引物区域。随后，反应体系中的核酸外切酶切除3'-末端的磷酸基团，产生3'-oh基团，引物延伸功能得以恢复，从而启动等温核酸扩增；
12、进一步地，所述荧光报告探针是根据靶标序列设计的，长度为2～100nt，且至少同时修饰有荧光团、淬灭团；
13、进一步地，在体系酶的协同作用下，目标核酸引发扩增，进而荧光报告探针断裂，荧光团与淬灭团空间分离，荧光恢复，实现实时荧光检测；
14、进一步地，整体反应可以在一个试管中封闭完成，且能实现实时荧光检测；
15、进一步地，所述等温扩增原料为dntps；
16、进一步地，所述目标核酸为dna或rna；
17、进一步地，所述高保真等温核酸扩增检测体系适用于常规等温核酸扩增体系，包括重组酶聚合酶等温扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、依赖解旋酶恒温扩增(hda)、依赖核酸序列扩增(nasba)、环介导等温扩增(lamp)中的任意一种；
18、进一步地，所述等温扩增酶为对应常规等温核酸扩增体系通用蛋白酶，至少含有一种聚合酶；
19、进一步地，所述反应缓冲液对应常规等温核酸扩增体系的通用反应缓冲液。
20、或者，所述常规等温核酸扩增体系包括一对常规引物、荧光报告探针、等温扩增原料、反应缓冲液、等温扩增酶和目标核酸。
21、步骤1所述引物的终浓度为10nm～10μm，荧光报告探针的终浓度为10nm～10μm；
22、步骤1所述等温扩增酶的终浓度为10ng/μl～1000ng/μl，酶的选用及其浓度与所采用的常规核酸扩增体系相关。
23、步骤1所述等温扩增原料的终浓度为10μm～100mm，以保证核酸扩增的高效进行；
24、步骤2所述特定波长光源的选择与所修饰的光敏分子的特性有关，需根据其特性进行相应的调整；
25、步骤2所述一定光照时间，与特定波长光源的功率有关，所使用的光源的功率越大，所需光照射时间越短，光源的功率越小，所需光照射时间越长。365nm光源照射的时间优选至少为1s；
26、步骤2所述高保真等温核酸扩增检测体系的反应温度或检测温度为1～100℃，检测时长至少为1min，以保证核酸扩增反应正常进行和体系中的酶不失活；
27、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
28、本专利技术设计高保真等温核酸扩增及检测体系，通过光解和去磷酸化双重激活策略，完全消除反应组分在预混过程中导致的预扩增，提高检测灵敏度。利用光激活策略，能够时空调控、通用性更强、实验操作更简单。同时，避免了开盖试剂转移过程，简化了实验操作，在确保高的检测灵敏度的同时，又保证了检测不受气溶胶污染影响。
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1.一种高保真等温核酸扩增检测方法及试剂盒，其特征在于，包括
2.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述光敏分子修饰于所述光笼引物内部；所述光敏分子选自光致异构型位阻基团、光致裂解型位阻基团的至少一种；所述光致裂解型位阻基团选自邻硝基苄基(O nitrobenzyl，ONB)及其衍生物、香豆素(Coumarin，CM)及其衍生物中的至少一种；所述光笼引物中光敏分子的修饰个数为1～100个，其中每隔1～100个碱基嵌入修饰一个光敏分子。
3.所述3'末端阻断分子修饰于所述光笼引物的3'末端，3'末端阻断分子包括胺、磷酸盐、C3 Spacer、生物素-TEG中任意一种。
4.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述荧光报告探针是根据靶标序列设计的，所述荧光报告探针中至少同时修饰有荧光基团、淬灭基团；所述荧光报告探针的长度为2～100nt。
5.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述高保真等温核酸扩增检测体系适用于常规等温核酸扩增体系，包括重组酶聚合酶等温扩增(R
6.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述等温扩增原料为dNTPs；所述目标核酸为DNA或RNA；所述等温扩增酶为对应常规等温核酸扩增体系通用蛋白酶，至少含有一种聚合酶；所述反应缓冲液为适用于常规等温核酸扩增体系的通用反应缓冲液。
7.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：步骤(1)中所述混合体系中光笼引物的终浓度为1nM～10μM，常规引物的终浓度为1nM～10μM，荧光报告探针的终浓度为1nM～10μM，等温扩增酶的终浓度为10ng/μL～1000ng/μL，等温扩增原料的终浓度为1μM～100mM。
8.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：步骤(2)中特定波长光照的时间至少为1s；反应温度或检测温度为1～100℃，检测时长至少为1min。
...【技术特征摘要】
1.一种高保真等温核酸扩增检测方法及试剂盒，其特征在于，包括
2.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述光敏分子修饰于所述光笼引物内部；所述光敏分子选自光致异构型位阻基团、光致裂解型位阻基团的至少一种；所述光致裂解型位阻基团选自邻硝基苄基(o nitrobenzyl，onb)及其衍生物、香豆素(coumarin，cm)及其衍生物中的至少一种；所述光笼引物中光敏分子的修饰个数为1～100个，其中每隔1～100个碱基嵌入修饰一个光敏分子。
3.所述3'末端阻断分子修饰于所述光笼引物的3'末端，3'末端阻断分子包括胺、磷酸盐、c3 spacer、生物素-teg中任意一种。
4.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述荧光报告探针是根据靶标序列设计的，所述荧光报告探针中至少同时修饰有荧光基团、淬灭基团；所述荧光报告探针的长度为2～100nt。
5.根据权利要求1所述高保真等温核酸扩增及检测体系，其特征在于：所述高保真等温核酸扩增检测体系适用于...
【专利技术属性】
技术研发人员：卿敏，陈欣，秦瑜繁，刘小琼，于超，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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